扶正解毒口服液質量控制方法研究
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摘要：目的 建立扶正解毒口服液的質量控制方法。方法 采用TLC法對扶正解毒口服液中的板藍根、黃芪和淫羊藿進行鑒別;采用HPLC法測定（R，S）-告依春的含量。結果 在薄層色譜鑒別中均能檢出板藍根、黃芪和淫羊藿的特征性斑點;以（R，S）-告依春對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，以峰面積（Y，μv）對濃度（X，μg/ml）進行線性回歸，繪制標準曲線，其回歸方程為：Y=45784.94X-17640.25，相關系數r=0.99997，試驗結果表明：（R，S）-告依春濃度在4.63～123.38 μg/ml，呈良好的線性關系。標準中建立的（R，S）-告依春的含量測定方法耐受性良好、靈敏度高、重現性好、專屬性強，可以有效控制產品的質量。結論本方法能準確、可靠的對扶正解毒口服液中（R，S）-告依春含量進行測定，可作為該制劑的質量控制方法。
關鍵詞：扶正解毒口服液;薄層鑒別;含量測定
中圖分類號：R286.0 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.07.029
文章編號：1006-1959（2019）07-0100-04
Abstract：Objective To establish a quality control method for Fuzheng Jiedu Oral Liquid. Methods TLC method was used to identify Radix Isatidis， Astragalus and Epimedium in Fuzheng Jiedu Oral Liquid. The content of （R， S）-Gu Yichun was determined by HPLC. Results The characteristic spots of Radix Isatidis， Astragalus and Epimedium were detected in the identification of TLC; the concentration of （R， S）-Guyuechun reference was taken as the abscissa， the peak area was the ordinate， and the peak area was（Y， μv） linear regression of concentration （X， μg / ml）， draw a standard curve， the regression equation is： Y=45784.94X-17640.25， correlation coefficient r=0.99997， the test results show：（R， S） - The concentration of spring was in the range of 4.63～123.38 μg/ml， showing a good linear relationship. The method for determining the content of （R， S）-Yueyichun established in the standard is well tolerated， sensitive， reproducible and specific， which can effectively control the quality of the product.Conclusion The TLC method can accurately and reliably determine the content of （R，S）-Gu Yichun in Fuzheng Jiedu Oral Liquid， which can be used as the quality control method of the preparation.
Key words：Fuzheng Jiedu oral liquid;Thin layer identification;Content determination
扶正解毒口服液由板藍根、淫羊藿和黃芪組成，功能扶正祛邪，清熱解毒[1]。用于治療雞傳染性法氏囊病[2]。傳統中藥散劑在禽病防治中常采用常規方式粉碎混勻給藥，由于雞的腸道較短，藥物在消化道的通過時間與家畜相比非常短，對纖維素的消化能力低，消化液中的消化酶只能將藥物中的很少一部分有效成分浸出，藥物的吸收利用率低，單位體重用量大，見效慢，同時仍大部分的藥材隨糞便而排出造成很大浪費。目前，提高中藥材的生物利用度已成為競相研究的熱點，而超微粉、提取粉、口服液的生物利用度理論上均高于散劑，經過對比幾種劑型的優劣勢，選擇將扶正解毒散經研究改變劑型為口服液，既提高藥物的生物利用度，又節約了成本。本文將扶正解毒散經研究改變劑型，開發為新獸藥扶正解毒口服液，原劑型產品質量標準較簡單只有顯微鑒別，沒有薄層和含量測定項。為了控制產品質量，筆者建立了扶正解毒口服液的質量控制方法。定性方面建立了黃芪、板藍根、淫羊藿的薄層色譜鑒別;含量方面建立了板藍根中的（R，S）-告依春含量測定，可作為該制劑的質量控制方法。 1材料與方法
1.1儀器與試藥 Agilent Technologies-1260型高效液相色譜儀，紫外可變波長檢測器，安捷倫色譜數據工作站;薄層色譜數碼相機成像系統GoodSee-20E，上海科哲生化科技有限公司。扶正解毒口服液，由河南牧翔動物藥業有限公司提供，批號：20170101、20170102、20170103。（R，S）-告依春對照品，含量100.0%，批號111753-20706;淫羊藿苷對照品，含量94.2%，批號110737-201516;以上均購自中國食品藥品檢定研究院。黃芪甲苷對照品，含量100.0%，批號110781-201717;購自中國藥品生物制品檢定所。硅膠G板、H板、GF254板;雙蒸餾水;甲醇、乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純。
1.2方法
1.2.1薄層鑒別 ①板藍根的薄層色譜鑒別：取本品10 ml，加水20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。取（R，S）-告依春對照品，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液[3]。另按照本處方藥材比例與制法，制備缺板藍根陰性溶液。吸取上述三種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置波長254 nm紫外光燈下檢視[4]。②淫羊藿的薄層色譜鑒別：取本品30 ml，用乙醚振搖提取2次，30 ml/次，棄去乙醚液，用乙酸乙酯振搖提取2次，30 ml/次，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇 2 ml使溶解，作為供試品溶液[5]。取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。另按照本處方藥材比例與制法，制備缺淫羊藿的陰性溶液。吸取上述三種溶液各5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：1：1：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃ 加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視[6]。③黃芪的薄層色譜鑒別：取本品20 ml，用水飽和正丁醇振搖提取3次，30 ml/次，合并正丁醇液，用4%氫氧化鈉溶液洗滌3次，30 ml/次，棄去堿液，再用水洗滌3次，30 ml/次，棄去水液，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，加入中性氧化鋁（100～120目）2 g拌勻，蒸干，用40%甲醇50 ml分次攪拌洗滌，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液[7]。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。另按照本處方藥材比例與制法，制備缺黃芪的陰性對照溶液。吸取上述三種溶液各2 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（13：7：2）10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃ 加熱至斑點顯色清晰。
1.2.2板藍根中（R，S）-告依春含量測定 ①色譜條件：以 Hypersil ODS2 C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）;流動相為甲醇-0.02%磷酸溶液（7：93），流速1.0 ml/min，檢測波長254。理論板數按（R，S）-告依春峰計算應不得低于5000。采用此色譜條件，流出的曲線基線穩定、分離度高，重復性好，因此本品采用此色譜條件[8]進行含量測定。②對照品溶液的制備：取（R，S）-告依春對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含40 μg的溶液，即得。③供試品溶液的制備：取扶正解毒口服液批號為20170101，精密量取5 ml，各四份，分別置于25 ml量瓶中。第1#供試品不超聲，第2#、3#、4#供試品加水適量，分別超聲處理10、20、30 min，放置室溫，加水定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液，作為供試品溶液。④專屬性試驗：依據處方中的比例，按制法制備缺板藍根陰性對照溶液，在選定的色譜條件下，同時取對照品溶液、供試品溶液、缺板藍根的陰性對照溶液進樣。⑤線性關系試驗：精密稱?。≧，S）-告依春對照品7.75 mg置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解，分別制成濃度為4.63、9.25、18.51、37.01、61.69、123.38 μg/ml，進樣10 μl，測定峰面積。⑥精密度試驗：取同一濃度（R，S）-告依春對照品溶液，進樣量10 μl，分別連續進樣6次。⑦重復性試驗：取同一批供試品（批號：20170101），按供試品溶液制備方法，制備6份樣品，在選定的色譜條件下，測定峰面積并計算含量。⑧穩定性試驗：取供試品（批號：20170101），按照供試品溶液制備方法配制溶液，在選定的色譜條件下，分別于0、2、4、8、12 h測定，測定峰面積并計算含量。⑨加樣回收率試驗：采用加樣回收法測定。精密稱?。≧，S）-告依春對照品5.31 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照儲備液。精密量取供試品溶液（批號為20170101，含量為114.4 μg/ml）6份，每份精密量取5 ml，置25 ml量瓶中，依次對應加入對照儲備液1 ml，加水定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，棄取初濾液，收集續濾液，即得供試品溶液，精密吸取對照品溶液和供試液各10 μl分別注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。⑩（R，S）-告依春含量限度測定：取連續批次生產的扶正解毒口服液10批，按供試品溶液制備方法處理，取10 μl進樣，記錄峰面積并計算含量。
2結果
2.1板藍根的薄層色譜鑒別 結果供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品色譜在相應的位置上無干擾，表明該方法專屬性強，薄層圖譜見圖1。
2.2淫羊藿的薄層色譜鑒別 結果供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的熒光斑點，陰性樣品色譜在相應的位置上無干擾，表明該方法專屬性強，薄層圖譜見圖2。 2.3黃芪的薄層色譜鑒別 結果供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點;置紫外光燈（365 nm）下檢視，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照樣品在相應的位置上無干擾。表明該方法專屬性強，薄層圖譜見圖3、圖4。
2.4板藍根中（R，S）-告依春含量測定
2.4.1供試品溶液的制備 在選定的色譜條件下，精密量取供試品溶液和對照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定結果為不超聲、超聲10、20和30 min，含量分別為115.8、115.5、115.3和115.9 μg/ml。結果表明樣品超聲與不超聲提取差別不大，因此，選用不超聲。
2.4.2專屬性試驗 供試品溶液色譜與對照品溶液色譜在相同的保留時間內有（R，S）-告依春色譜峰，而陰性對照溶液無此峰，說明扶正解毒口服液的其它成分對（R，S）-告依春的測定無干擾。
2.4.3線性關系試驗 標準曲線回歸方程為：Y=45784.94X-17640.25，相關系數r=0.99997，（R，S）-告依春濃度在4.63～123.38 μg/ml內呈良好的線性關系。
2.4.4精密度試驗 測定記錄（R，S）-告依春峰面積，平均峰面積為1707201.88，其RSD為0.3%，儀器精密度良好。
2.4.5重復性試驗 平均含量為114.4μg/ml，RSD為0.2%，重復性良好。
2.4.6穩定性試驗 平均含量為113.5μg/ml，RSD為0.4%，供試品溶液中（R，S）-告依春在12 h內保持穩定。
2.4.7加樣回收率試驗 平均加樣回收率為99.7%，RSD為0.3%，具有良好的回收率，見表1。
2.2.8 （R，S）-告依春含量限度測定 按選定的色譜條件，測定10批中試產品平均含量為115.6 μg/ml，以降低20%限度計，含量限度定為本品中每1 ml含板藍根按（R，S）-告依春（C21H18O11）計，不得少于90.0 μg/ml。
3討論
扶正解毒口服液的成分復雜，為了在生產中能保證藥品質量，選擇用薄層色譜法對板藍根、黃芪和淫羊藿進行定性鑒別，能清晰的看到板藍根、黃芪和淫羊藿的特征性斑點。研究表明，板藍根含有多種化學成分，并具有抗病毒藥理活性，抗病毒主要代表性物質基礎為（R，S）-告依春[4]。含量測定采用高效液相色譜法測定扶正解毒口服液中（R，S）-告依春的含量，具有重要意義，該方法簡便、快速、準確，可以應用于生產中的質量控制。
板藍根中化學成分復雜，主要含（R，S）-告依春以及多種氨基酸等。以精氨酸為考察指標，供試品處理后，斑點分不開，還不在同一位置，原因可能是多糖類成分有干擾;精氨酸專屬性不強，山藥和蘋果皮等都含有。因按藥典板藍根藥材供試品溶液的制備方法制的供試品溶液，點樣困難，展開后，斑點不清晰，會造成假陰性，因此修訂優化該方法，選擇水做溶劑提取，有效成分提取充分，易點樣，供試品中（R，S）-告依春的斑點清析，陰性無干擾。淫羊藿含有黃酮類化合物、木脂素、生物堿、揮發油等?？疾觳患右颐亚疤幚恚唿c不清晰，分離度差。增加了乙醚前處理，使藥液脫脂，采用TLC法，分離效果好，斑點清晰，重現性好，收入標準。黃芪含有黃酮類、多糖類、皂苷類成分。處理過程先用水飽和正丁醇萃取，堿液洗滌，再水洗，正丁醇液蒸干，甲醇溶解，過中性氧化鋁柱，洗脫，供試品經過處理后，采用TLC法，分離效果好，斑點清晰，重現性好，收入標準。按選定的色譜條件，測定10批中試產品（R，S）-告依春平均含量為115.6 μg/ml，以降低20%限度計，含量限度定為本品中每1ml含板藍根按（R，S）-告依春（C21H18O11）計，不得少于90 μg/ml。
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收稿日期：2018-12-21;修回日期：2019-1-15
編輯/成森
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