沙棘CAT家族基因的生物信息學分析

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　　摘    要：CAT （Cationic amino acid transporters）是植物體內參與氨基酸的吸收與轉運的一類跨膜轉運蛋白。為探究CAT   家族基因及其所編碼蛋白的結構特征，本研究依據前期所獲得的不同發育期沙棘果實的轉錄組測序數據，經過功能注釋與分析后獲得3 個CAT家族成員基因，分別命名為HrCAT1、HrCAT2和HrCAT3，并對其進行生物信息學分析。結果表明，沙棘果實HrCA  T  家族基因均含有完整的開放閱讀框，編碼二級結構以α-螺旋為主、不含信號肽的非分泌蛋白，其中HrCAT 1和HrCAT 2蛋白的三級結構之間具有較高相似性。研究結果可為后續研究沙棘果肉HrCAT基因的表達調控提供理論依據。
　　關鍵詞：沙棘果實; 氨基酸轉運體; 家族基因; 生物信息學分析
　　中圖分類號：S663.9         文獻標識碼：A            DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.05.001
　　Bioinformatic Analysis of CAT Gene Family in Sea Buckthorn
　　XU Shiqi， LI He， DENG Yiyi， ZHU Yuanling， DENG Jinlan
　?。–ollege of Environment and Resources， Dalian Minzu University， Dalian， Liaoning 116600， China）
　　Abstract：  Cationic amino acid transporter （CAT） is involved in the uptake and transport of amino acids in plants. The aim of this paper was to study the CAT family genes and structural characteristics of encoded proteins. According to our previous RNA sequencing data from developing fruits of sea buckthorn， the genes encoding for the CAT transport proteins were functionally annotated and a total of three genes were characterized to encode for the CAT family， named as HrCAT  1， HrCAT2 and HrCAT3， respectively. The results of bioinformatics analysis showed that all the identified HrCAT genes contained complete open-reading frame（ORF）， which could encode α-helix secondary structure， and non-secretory protein without signal peptide. There was a high similarity in tertiary structure between of HrCAT1 and HrCAT2 proteins. These results could provide a theoretical basis for further studies on the expression regulation of HrCAT genes in sea buckthorn fruit.
　　Key words： sea buckthorn fruit;cationic amino acid transporter;family gene; bioinformatics analysis
　　氨基酸是生物大分子蛋白質的基本單位，小分子極性物質的本質造成其在生物體內無法自由通過細胞質膜，需要相關轉運蛋白的協助才能完成跨膜轉運。植物中的氨基酸轉運蛋白依據基因序列的同源性可分為ATFs （the amino acid transporter family） 和 APCs （the amino acid polyamine cholinetransporter） 兩大家族[1-2] ，其中陽離子氨基酸轉運體（CAT， Cationic amino acid transporters）屬于后者。目前，對于CAT的研究主要集中在擬南芥[3]、楊樹[4]和番茄[5]等少數植物，有關沙棘果實CAT家族基因方面研究尚未見報道。
　　沙棘 （Hippophae rhamnoides L.） 是一種落葉性灌木，耐旱抗風沙，生命力極強，在我國分布廣泛，常應用于水土保持。其果實含有豐富的營養物質和生物活性物質，如必需氨基酸、維生素C、維生素E、類胡蘿卜素、不飽和脂肪酸等，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品和保健品等領域，具有很高的經濟價值[6-7]。沙棘果肉中的氨基酸具有種類多和必需氨基酸較高等特點，是良好的植物蛋白來源[8]。因此，開展沙棘果實發育過程中氨基酸轉運蛋白的功能研究，為將來果實中功能蛋白的開發具有重要意義。
　　本研究以前期獲得的不同發育期沙棘果實的轉錄組數據為基礎，挖掘CAT 家族基因成員并進行生物信息學分析，對沙棘果肉中HrCAT蛋白的結構特征和功能進行預測，研究結果可為探索沙棘果實不同發育時期CAT蛋白的累積規律及調控機理研究奠定理論基礎。 　　1 材料和方法
　　1.1 蛋白累積相關基因的篩選
　　對前期所獲得的不同發育時期沙棘果實轉錄組測序數據進行基因注釋、GO分析、KEGG代謝通路分析等一系列后續分析，篩選出樣品間差異表達的基因，基于這些差異表達基因進行GO功能顯著性富集分析和Pathway顯著性富集分析，最后篩選出蛋白質累積途徑中的CAT家族基因序列。
　　1.2 生物信息分析
　　利用各類生物信息在線工具和軟件對目的基因的測序結果進行分析。篩選出HrCAT家族的核酸序列，用NCBI網站的在線工具ORF finder確定其開放閱讀框，使用DNASTAR軟件將核苷酸序列轉換成氨基酸序列。之后利用ExPASy網站的ProtParam和ProtScale工具分析HrCAT家族基因編碼蛋白的理化特性。ProtScale在線分析中，對蛋白質的氨基酸序列及其折疊后的空間結構進行分析測算，結果為負值說明該蛋白為親水性蛋白，反之為疏水性蛋白。預測閾值常設定為1.6～2.0，窗口大小推薦設定為7，9，11（通常為單數）。使用SignalP[9]和TMHMM 2.0 Server[10]對蛋白中的信號肽序列和跨膜區進行預測。利用SOPMA和Phyre2[11]預測HrCAT蛋白的二級結構并進行三級結構的建模。
　　2 結果與分析
　　2.1 HrCAT家族基因的注釋及生物信息學分析
　　對沙棘轉錄組測序得到的數據進行注釋與篩選，獲得了CAT家族基因中的3個成員，分別命名為HrCAT  1、HrCAT   2和HrCAT  3。通過NCBI網站上的 ORF finder 工具，分析3種 HrCAT   基因的核酸序列。結果表明，3種HrCAT 基因分別具有長度為3 646，1 373，2 387 bp的完整開放閱讀框（open reading frame， ORF），分別編碼 540，353，648個氨基酸，表明3種 HrCAT 基因均具有編碼完整基因的獨立性（表1）。疏水性總體平均值分別為0.547，0.429和0.557，屬于疏水性蛋白。
　　2.2 HrCAT家族基因編碼蛋白質的理化性質分析
　　利用ProtParam工具分析后可知，3種HrCAT基因編碼的蛋白具有相似的分子式，不穩定指數均為Ⅱ級，表現為穩定蛋白。預測6種HrCAT基因所編碼蛋白的分子量分別為137.90，88.87，162.91 kD，理論等電點為5.01，5.15，4.97 （表2）。
　　2.3 HrCAT家族蛋白信號肽和跨膜區的預測
　　應用SignalP.4.1對PsCAT家族蛋白進行信號肽的預測和分析，結果發現，3種HrCAT蛋白的C值和Y值均小于+1，S值無明顯變化，且無明顯的信號肽特征（圖1），表明3種HrCAT蛋白均不含信號肽，屬于非分泌蛋白。
　　利用TMHMM 2.0 Server進行HrCAT家族蛋白的跨膜區分析，結果顯示，HrCAT1、HrCAT2和HrCAT3分別含有14個、10個和14個跨膜結構域，均屬于跨膜蛋白（圖2）。預測結果與疏水性結果分析一致，表明3個蛋白均為跨膜轉運蛋白，承擔氨基酸在膜內外的運輸工作。
　　2.4 HrCAT家族蛋白的結構預測
　　應用在線工具SOPMA預測PsCAT家族蛋白的二級結構（表3）。通過比較分析后發現，3種HrCAT蛋白的二級結構均由α-螺旋、β-折疊和無規卷曲4種結構元件組成，其中α-螺旋所占比例均為最高、其次為無規卷曲，β-折疊所占比例最少，根據蛋白結構類型的分類方法，3種HrCAT蛋白均屬于混合型蛋白，且二級結構彼此之間具有較高相似性。另外，3種HrCAT蛋白中均含有較高比例的無規卷曲結構，而無規卷曲結構常受側鏈影響從而構成蛋白質的活性部位[12-13]。
　　通過Phyre2服務器同源構建模型預測PsCAT蛋白的三維結構[14]，經序列對比分析后，分別以C4DJIA蛋白和C4M57A蛋白的核磁模型為模板構建模型。結果表明，在3種HrCAT蛋白的三級結構中占比最多的均為α-螺旋，其次為無規卷曲，這與其二級結構預測的結果一致。另外，HrCAT1和HrCAT2蛋白的三級結構之間具有較高相似性，二者與HrCAT3蛋白的三級結構的相似度較低（圖3）。
　　3 結論與討論
　　CAT是一類堿性跨膜轉運蛋白，屬于 APCs 家族，主要參與植物體內氨基酸的吸收與轉運。近年來，在擬南芥和楊樹中已發現多個CAT 家族成員，CAT家族基因的調控與表達水平，突變體功能缺失等方面已成為研究熱點[15]。由于蛋白質累積過程中調控機制十分復雜，CAT 調控蛋白相關功能基因表達的分子機制尚不明確，蛋白理化性質和結構解析等方面鮮有報道。本研究中采用生物信息學方法對沙棘果實HrCAT   家族所編碼蛋白的理化性質、結構和功能等方面進行分析與預測，探索植物CAT家族蛋白的結構與功能特點。
　　沙棘果實中HrCAT   家族編碼蛋白均含有跨膜區，這與其吸收與轉運氨基酸的功能密切相關。二級和三級結構分析表明，HrCAT家族基因編碼蛋白的二級結構均由α-螺旋、β-折疊和無規卷曲3種結構組成，HrCAT1和HrCAT2蛋白的三級結構具有較高的相似度。這揭示沙棘果肉中的HrCAT1和HrCAT2基因在功能方面可能具有較高的相似性，而HrCAT3蛋白初步推測可能具有某些特異性功能。推測沙棘果肉中的3種CAT基因在調控不同種類氨基酸的吸收和轉運時發揮的功能存在多樣性與特異性。本研究結果為進一步探索沙棘果肉蛋白的累積規律及調控機理提供科研依據與基礎，具有重要的學術價值和應用前景。
　　
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