分子生物學在蝗蟲研究中的應用
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摘 要：本文綜述了分子生物學方法對蝗蟲的系統分類、進化關系、全基因組測序、轉錄組測序以及功能基因等方面的研究現狀，為蝗蟲研究與防治提供一定的參考。
關鍵詞：蝗蟲;系統發育;全基因組;功能基因
中圖分類號：S-33
文獻標識碼：A
DOI：10.19754/j.nyyjs.20190630007
蝗蟲即蝗總科昆蟲的統稱，歸屬于昆蟲綱直翅目。因其地域分布廣泛、雜食性、食量大、適應性強等特點是主要的農業害蟲，我國有1200多種[1]，其中飛蝗能夠長距離遷飛，對農業生產危害最大，飛蝗又分為群居型和散居型，群居型飛蝗危害有大于散居型，兩者可發生型變。隨著生物技術以及研究方法的不斷更新和完善，對蝗蟲的研究也逐漸從宏觀轉向微觀，尤其對2型轉變機制的研究等。
1 系統分類與進化關系
利用基因克隆技術，獲得目的基因，并采用生物信息分析軟件等對多樣本目的基因進行比對分析、構建進化樹等以此研究相互親緣關系、進化關系。目前，用于蝗蟲分類構建親緣關系、進化關系圖譜的基因有16SrDNA、18SrDNA、CoⅠ、CoⅡ基因等[2]，因上述基因序列均具有高度保守性，序列大小適中且較易通過克隆測序獲得而被用于系統分類和進化分析。其原理是根據物種間的基因高度保守區域反映物種間的親緣關系，序列的差異區域而區分種間關系。
1.1 16SrDNA、18SrDNA序列
16SrDNA是編碼核糖體RNA亞基（16SrRNA）的基因，其具有高度保守性，且廣泛存在于原核生物中，是分子分類最為常用的序列;18SrDNA是廣泛存在于真核生物編碼核糖體亞基的基因，也是分子系統發育常用序列，與16SrDNA一樣具有高度保守性。截至目前，Filipenko KL[3]等人利用16SrDNA的部分序列對九種蝗蟲進行系統發育關系構建。印紅、張道川[4]等人獲得了錐頭蝗科、斑腿蝗科等蝗總科8個科的16SrDNA，并分析構建了進化樹及相應的進化關系。李新江[5]等人利用16SrDNA對6種短鼻蝗構建了系統發育關系。印紅等獲得了18SrDNA全長序列，并以此構建了系統發育樹，進一步以分子生物學手段印證了形態分類結果闡明了親緣關系。
1.2 CoⅠ、CoⅡ基因
CoⅠ、CoⅡ基因即細胞色素氧化酶亞基1亞基和2亞基，是細胞色素氧化酶的重要組成，均存在與線粒體中，與線粒體的呼吸作用起到關鍵性作用，此外，此2個基因序列均較為保守，常被用作系統發育關系研究的序列。在蝗蟲這一物種的研究中，黃原[6]等人通過CoⅠ基因序列的測定，對斑腿蝗科的7個種進行了系統分類研究，其研究結果與形態分類保持一致。馬蘭[7]等人通過CoⅡ基因片段的測定分析，對22種蝗蟲進行系統發育樹的構建，并對其序列進行分析，闡明其間的相互親緣關系。肖莉莉[8]、劉艷[9]、張辰艷[10]等人分別對不同蝗蟲物種線粒體基因組全長序列進行了測定與分析，為蝗蟲研究提供了重要的分子基礎。
2 全基因組測序與DNA甲基化測序
2.1 全基因組測序
隨著計算機技術的不斷進步以及測序平臺的不斷更新換代，全基因組測序逐漸趨于成熟、成本下降，全基因組測序也逐步成為實驗研究的重要手段。全基因組測序是指對整個生物個體且未知其基因序列利用鳥槍法等獲得整個生物個體基因序列。2014年，康樂[11]等人利用全基因組鳥槍法獲得了一個經過8代近交的蝗蟲雌性個體的全基因組序列，并構建了系統發育樹。其研究結果表明，飛蝗基因組是目前已知動物基因組中最大的，達到6.5Gb，共包含17307個基因，這些基因也已被其他實驗數據得以驗證，如同源基因、RNA-seq/EST等，其中通過數據庫比對發現蝗蟲特有基因4571個。其研究結果還提出蝗蟲基因組中存在大量重復序列，多達2639個重復序列家族，且內含子較長于其他昆蟲，但外顯子個數相當。通過系統進化樹分析進一步印證了不完全變態為多系群，且蝗蟲（直翅目）比準新翅目（蚜蟲和體虱）更古老?；认x的全基因組的序列成功獲得，將為蝗蟲研究奠定分子基礎，也為其他昆蟲的基因組測定提供了一定的基因注釋參考。
2.2 DNA甲基化測序
DNA甲基化即DNA堿基被甲基轉移酶催化而轉化成含有甲基的堿基，DNA甲基化通常會造成基因表達受到抑制。在早期對蝗蟲的研究中，楊鵬程[12]等人利用RRBS即重亞硫酸鹽測序對蝗蟲全身樣品和群居、散居兩型腦部樣品進行了甲基化測序，其結果指出，在全身樣品中均存在不同程度的甲基化，4%的甲基化出現在CG位點且主要分布于外顯子;在兩型腦部樣品中206個存在差異，此項研究也為日后蝗中生理、防治等提供了新的研究方向。
3 轉錄組測序
轉錄組指在一定條件下，所研究樣本的所有轉錄產物，其包括mRNA、tRNA等，但實際實驗研究中多為mRNA。截至目前，我國學者康樂、黃元等人先后對不同蝗蟲物種，不同發育階段進行了轉錄組測序并對所獲得的轉錄本進行了分析。其中，康樂教授首次發表了飛蝗從頭轉錄組測序結果[13]，其結果鑒別出了105種反轉錄子，揭示了1個 copia、1 個BEL、8 個gypsy 和23個非長末端重復反轉錄子，并且確定了可能參與蝗蟲發育相變等相關基因，這將會為日后蝗蟲的治理提供一定的分子基礎。黃元等[14]利用PacBio RS II測序平臺對中華稻蝗、中華劍角蝗和短額負蝗進行了轉錄本測序，分別獲得了全長轉錄本35995條、32817條、41125條，其中中華稻蝗共有24955條轉錄本具有開放式閱讀框，中華劍角蝗23161條，短額負蝗28281條，并通過注釋分析獲得了大量與生長發育、免疫等相關功能基因。這些大量的轉錄本數據不僅為日后研究蝗中生長發育等分子機制提供了數據基礎，也將為研制蝗蟲防治藥物提供支持。
4 功能基因 4.1 化學感受基因
化學感受基因（Chemosensory genes，CSP）是昆蟲在其生命過程中用來覓食、求偶、交流等系列行為極為關鍵的一類蛋白基因。飛蝗基因組中已鑒定的共有37個化學感受基因，在群居和散居蝗蟲的研究中，有學者[15]闡述并證明了飛蝗的受氣味誘導機制在兩型轉變過程中至關重要。姜峰等對兩型飛蝗的CSP基因的分析表明，其在兩型發育過程中表達具有顯著地分布差異性，在蟲卵階段，群居性表達量要低于散居型，但隨著不斷發育，其表達量逐步提升。在蝗蝻與成蟲階段群居型飛蝗CSP基因表達量均較高，達到36%。
4.2 Hexamerin
Hexamerin為超家族蛋白，具有高度保守性。昆蟲中的此類蛋白雖然與節肢動物的血藍蛋白相似，但其不能像節肢動物血藍蛋白那樣能夠攜氧，不能與銅離子結合，而是進化成了一類能夠儲存、釋放氨基酸的功能蛋白，起到調節營養吸收的作用[16]。目前，在飛蝗基因組中共鑒定了15個Hexamerin基因，明顯高于其他昆蟲，其氨基酸組成方面，谷氨酸含量中等，丙氨酸、纈氨酸含量較高[15]。
4.3 解毒基因及害蟲防治靶點
在蝗蟲中返現的解讀相關基因主要有UDP-葡基轉移酶（UDP-glycosyltransferases，UGT）、谷胱甘肽S-轉移酶、3羧基/膽堿酯酶、ATP結合盒式蛋白和細胞色素P450超家族等[15]。其中UDP-葡基轉移酶主要參與昆蟲對之物等有毒物質進行解毒的作用，在飛蝗中已鑒定出68個UDP-葡基轉移酶，這個數目明顯多于其他昆蟲，其序列均保持一定的相似度，且具有明顯的UDP-葡基轉移酶結構域。谷胱甘肽S-轉移酶也具有顯著地解毒功能，其主要是通過催化谷胱甘肽結合反應進而起到解毒作用。在飛蝗中，有28個谷胱甘肽S-轉移酶基因，且其全部存在于細胞溶質里。羧基/膽堿酯酶是主要的殺蟲劑及農藥作用點，其主要通過控制外來有毒物質的解毒以及神經發育過程，在飛蝗中羧基/膽堿酯酶主要分為3類，即取食/解毒、激素/化學信息素加工和神經/發育，目前以堅定出個數分別為39、32、9。ATP結合盒式蛋白即ATP-binding cassette transporter，ABC蛋白家族是一類廣泛分布于各類生物中的基因，其主要功能包括底物轉運、磺脲抑制劑和核糖體組裝因子等。在飛蝗中有65個家族成員，其在蝗蟲中主要有殺蟲劑耐受和代謝調節，其中ABCB和ABCC亞家族數目分別為19和9個，對外來毒物有解毒作用。大量證據表明P450基因與殺蟲劑抗性有關，而蝗蟲中有94個P450基因成員，數目要高于體虱和蚜蟲，但和其他昆蟲相當。
5 討論
在分子水平，對蝗蟲的研究已經取得突破性的進展，獲得了大量的分子數據，例如與系統發育研究相關的的6SrDNA、18SrDNA、CoⅠ、CoⅡ基因以及線粒體基因組全場序列，飛蝗的全基因組序列、大量的不同蝗蟲/不同生長發育階段的轉錄組數據等，這些數據為進一步研究蝗蟲的進化、型變、適應性等分子機制奠定了基礎，同時也為日后在蝗蟲的防治用藥的研究提供了理論依據。但如此龐大的數據，尤其飛蝗基因組數據等以及功能基因、相關分子機制都有待于進一步挖掘、研究。
參考文獻
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作者簡介：
楊坤（1990-），男，碩士研究生，研究方向：蝗蟲鼠害防治工作。
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