恩拉霉素人工抗原的合成與鑒定

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　　摘要：建立酶聯免疫方法以檢測食品中恩拉霉素的殘留，采用戊二醛法，偶聯半抗原恩拉霉素（Er）和載體牛血清白蛋白（BSA）或卵清白蛋白（OVA），制備人工免疫抗原和人工包被抗原，分別為Er-BSA和Er-OVA。經紫外光譜鑒定，在紫外270～280 nm波長處得到Er-BSA和Er-OVA特征性偶聯吸收峰。試驗結果表明人工合成的2個人工抗原均偶聯成功。人工免疫抗原和人工包被抗原的偶聯比均達到26∶1，為進一步制備抗血清和酶聯檢測方法的建立奠定了基礎。
　　關鍵詞：恩拉霉素;抗原合成;戊二醛法
　　中圖分類號：S859.79+6         文獻標識碼：A
　　文章編號：0439-8114（2019）07-0092-04
　　Abstract： In order to establish an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for examing residual Enramycin （Er） in food. The antibody with high titer and specificity must be firstly prepared. So it was necessary for antibody production to conjugate the hapten （Er） with a carrier protein to synthesize immunogent（antigen）. Enramycin was coupled with carrier protein bovine serum albumin （BSA） to obtain immunogent （Er-BSA） by glutaraldehyde （GA） method and with ovalnumin （OVA） to obtain coating antigen（Er-OVA） by GA respectively. The successful linkage of Er-BSA and Er-OVA were identified by UV spectrophotometry. The UV spectral characterization demonstrated that Er-BSA and Er-OVA were successfully synthesized at 270～280 nm. The coupling ratios between Er and BSA or OVA were determined to be 26∶1， respectively.
　　Key words： Enramycin; synthesis of antigen; glutaraldehyde method
　　恩拉霉素（Enramycin，Er）又名恩霉素，是日本武田藥品研究所于1966年由土壤中分離出來的放線菌（Streptomyces fungicidious No. B5477）經發酵產生的一種由不飽和脂肪酸和十二種氨基酸結合而成的多肽類（Polypepide）抗生素[1-4]，其主要成分是恩拉霉素A：C107H138N26O31C12 R=CH3和恩拉霉素B：C108H140N26O31C12 R=C2H5OH，其結構式見圖1。該藥因具有很強的抗G+菌的作用，化學性能穩定，能促進畜禽生長和提高飼料效率，且不易產生耐藥性，與其他抗生素亦無交叉耐藥，無致突、致畸、致癌作用且適口性好等優勢，現已成為最具發展前景的獸用抗生素添加劑。但目前國內外尚無有關Er酶免疫檢測技術的報道[3-6]，僅日本厚生省對該項殘留物質有畜、水產性食品常規檢測技術報道[7]。因此建立Er殘留物的免疫學檢測方法非常必要，制備出特異性強、效價高的Er抗體非常關鍵，但是Er分子量小，不具免疫原性，只有與大分子載體蛋白偶聯成為完全抗原后才能刺激動物機體發生特異性免疫反應。為此，本研究采用戊二醛法合成人工抗原，并用紫外光譜法（UV）鑒定抗原，為下一步制備抗Er多克隆抗體、單克隆抗體及檢測試劑盒奠定了基礎，以期為Er殘留檢測方法的建立提供研究材料。
　　1  材料與方法
　　1.1   材料與儀器
　　恩拉霉素（純度≥98%，由“進出口動物產品恩拉霉素藥殘檢測技術研究”課題組純化，簡稱Er）;牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、弗氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant，FCA）、弗氏不完全佐劑（Freund's incomplete adjuvant，FIA）、透析袋（截留分子量：14 000 Da）均購于Sigma公司;戊二醛、1，4-二氧六環、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4、Na2CO3、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），以上化學試劑均為分析純;去離子水;UV2501-PC型紫外掃描儀;BS124S型電子天平;BS100S型分析天平;ULT1386-3-V38型低溫冰箱;DCD-172K型常規冰箱;Freeze 6型冷凍干燥機;DF-101S型智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器。
　　1.2  方法
　　1.2.1  恩拉霉素-BSA免疫抗原的合成  采用戊二醛法（glutaraldehyde，GA）[7]合成恩拉霉素人工免疫抗原，其原理見圖2。
　　1.2.2  試劑配制  磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：稱取71.64 g Na2HPO4·2H2O和31.21 g NaH2PO4分別配制成0.20 mol/L的1 000 mL兩種PBS溶液;戊二醛溶液：將其配成濃度為0.25%的100 mL戊二醛溶液;透析袋洗滌液：配制含碳酸鈉10 g/L及EDTA 1 mol/L的堿性EDTA透析袋洗滌液。 　　1.2.3  抗原合成  將PBS配成pH=7.20的磷酸鹽緩沖溶液100 mL于三角瓶中;稱取Er 20 mg于100 mL錐形瓶中，稱取BSA 20 mg于5號試管中。向試管中加配好的PBS溶液約3 mL，將BSA完全溶解后轉移到Er的錐形瓶中，再用PBS洗滌試管，將BSA完全移入錐形瓶，共用PBS溶液10 mL。向錐形瓶中加入1，4-二氧六環10 mL，混勻。將磁力攪拌子放入錐形瓶后把錐形瓶放在一個含少量水的大燒杯中，再將燒杯置于25 ℃水浴，開啟攪拌器。約5 min后，向反應器內逐滴加0.25%戊二醛溶液5 mL。滴加完畢后仍保持攪拌狀態，反應4 h。
　　1.2.4  透析、干燥和保存  裁取長約20 cm的透析袋（分子截留量14 000 Da），將其置于堿性EDTA中煮沸30 min后用去離子水洗凈。取100 cm長的棉線一根，用其一端將透析袋的一端扎緊。取15 cm的三角漏斗一個，將其下部插于透析袋的未封口端，將上一步所得反應物經由漏斗口轉移至透析帶內。轉移完畢，利用棉線的另一端將透析袋封口。以一個小鑷子為梁將裝好的透析袋懸于盛有適量去離子水的大燒杯中（燒杯內的水能完全浸沒透析袋內的液體）。將該裝置放在4 ℃的冰箱內透析72 h，每天換水2次。將透析袋內液體轉入20 cm平皿中，并用橡皮筋將薄膜固定封口。用鑷子的尖端在平整緊繃的薄膜表面扎出若干小孔，-20 ℃下冷凍干燥2 d。將凍干的絮狀產物分為兩部分：一部分于4 ℃下保存供測試用，一部分于-20 ℃分裝保存供免疫用。
　　1.2.5  Er-OVA包被抗原的合成  包被抗原的制備與合成方法基本與免疫抗原制備方法相同，僅將所用的BSA連接蛋白置換成OVA，制備成Er-OVA包被抗原，合成路線見圖3。該抗原合成后可為免疫動物抗血清效價的檢測和ELISA檢測方法的建立奠定基礎。
　　1.2.6  紫外吸收光譜法鑒定  配制 BSA、OVA、Er 標準溶液， 將BSA、OVA、Er、Er-BSA、Er-OVA進行適當比例稀釋，使物質最大吸光度不超過4.0，以PBS為參比溶液，在200～400 nm范圍內進行紫外掃描，分別記錄吸收峰并根據最大吸收峰是否發生偏移，判斷完全抗原合成成功與否[8-11]。
　　1.2.7  抗原蛋白質量濃度的測定  偶聯物的絕對含量通常以蛋白質的相對質量濃度來表示（即每1 mL偶聯物溶液中含蛋白質多少毫克），所以可通過測定偶聯物中蛋白質的相對含量（mg/mL）來測定偶聯物濃度[12]。于紫外光譜波長280 nm和260 nm處檢測抗原蛋白的吸光度（OD值），通過公式（1）計算抗原蛋白相對濃度（mg/mL）[13]。根據蛋白質量濃度推算大白兔免疫劑量，進行抗血清（抗體，Ab）制備，為ELISA快速檢測試劑盒的構建提供素材。
　　蛋白質量濃度（mg/mL）=（1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm）×稀釋倍數   （1）
　　1.2.8  抗原偶聯比計算  用紫外分光光度法測定恩拉霉素人工抗原分子偶聯比。分別配制質量濃度2.5 mg/mL的BSA免疫抗原、2.0 mg/mL的OVA包被抗原工作液，進行紫外全波長掃描，利用214 nm和278 nm處OD值通過公式計算得出偶聯比（即Lambert-Beer定律計算偶聯比）[14]。
　　2  結果與分析
　　2.1  人工抗原的紫外光譜鑒定
　　采用UV2501-PC型紫外掃描儀對Er、BSA、OVA和2種制備抗原進行紫外全波段掃描，波長范圍200～400 nm。結果得出，Er標準品紫外最大吸收波長為279 nm，BSA紫外最大吸收波長為278 nm。當Er與BSA偶聯形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波長偏移至Er和BSA特征峰之間，提示本次合成得到了Er與BSA偶聯的免疫抗原Er-BSA（圖4）。而從圖5可以看出，Er和OVA偶聯產物的紫外全波段掃描曲線較之于反應物OVA，峰形變緩，278 nm的最大吸收峰稍向左移，形狀更接近于Er，初步說明偶聯成功。此外，此次所得Er-OVA產物曲線較之之前的Er-BSA曲線稍有波動，可能與反應物純度有關，BSA的純度達到了98%，而OVA純度不到90%。
　　2.2  抗原偶聯比
　　利用表1、圖4和圖5的數據，根據公式（2）分別計算得到Er-BSA的免疫抗原偶聯比為26.04∶1，Er-OVA的包被抗原偶聯比為26.07∶1。
　　3  小結與討論
　　3.1  抗原合成方法
　　對半抗原而言，人工抗原的合成和改造是免疫檢測研究的第一步，能否成功合成全抗原是非常重要的。另外，作為一個完全抗原必須同時具備T細胞和B細胞表位。小分子物質由于分子太小一般難以同時擁有2個表位，必須將其連接到一些大分子蛋白載體以形成偶聯物，借助大分子T細胞表位間接誘導B細胞激活、分化增殖，產生針對半抗原的特異性抗體[15，16]。在人工抗原的合成中，要注意盡量保留人工抗原中原有半抗原的原始立體構象和電子分布特征，半抗原分子越少，越應注意保留其特征基團不被改變[17]。Er是低分子多肽類化合物，是僅具反應原性而不具免疫原性的半抗原，其結構中氨基和酚基均可作為偶聯基團，但以往的試驗數據表明，酚基偶聯的效果不佳，故選用氨基為偶聯基團。因此，在不改變半抗原特征性結構的前提下，采用戊二醛法同時合成免疫原和包被原，期望制備出特異性強、選擇性好、對間隔臂親和性低的抗體[16];同時，由于戊二醛帶有2個活性基團的雙功能連接劑，借助其兩端的醛基將載體和半抗原的氨基連接在一起，可較重氮化法UV吸收峰不易重疊。 　　試驗通過偶聯劑戊二醛將載體蛋白氨基與半抗原Er分子中D-Orn4和Cit-9上的氨基偶聯，整個偶聯反應在PBS和二氧六環反應條件下進行，其中PBS具有穩定反應的pH，并為反應提供水溶液環境，二氧六環既可調整反應環境的極性條件，又能促進醛基的反應，最終獲得全抗原Er-BSA和Er-OVA，且通過紫外光掃描判斷偶聯成功。
　　3.2  載體蛋白的選擇
　　已報道的載體主要有蛋白質載體，如BSA、OVA、鑰孔血藍蛋白（KLH）、人血清蛋白（HSA）等;多聚鈦，如多聚賴氨酸、寡聚賴氨酸等;大分子聚合物，如羧甲基纖維素聚乙烯吡咯烷酮等。蛋白載體較為常用， 尤其是BSA分子中含有大量的賴氨酸，故有許多自由氨基存在， 且在不同pH和離子強度下能保持較大的溶解度，被有機溶劑（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解時其活性基團仍呈可溶狀態。OVA的理化性質不及BSA穩定，其對交聯反應的條件變化耐受性較差，但與BSA的親緣關系較遠，交叉反應程度卻很低，選用OVA在特異性試驗中能很方便地去除針對BSA的抗體，降低試驗中的勞動強度。同時對其他可選用的載體蛋白而言，OVA也廉價易得;故本試驗制備免疫原和包被原分別用的是BSA和OVA[18-20]。
　　3.3  抗原偶聯比
　　人工抗原質量鑒定的一個最重要的方面是確認半抗原與載體的連接和測定結合比，半抗原與載體偶聯時，連接過多的半抗原，并不意味著實際的免疫效果就一定好，結合物中半抗原分子數目太多或太少，誘發抗體的能力都很差。偶聯物的結合比是指偶聯物中半抗原與載體蛋白的分子個數之比，結合比適當的偶聯物作人工抗原，能夠獲得特異性強、效價高的抗血清。以BSA為載體的偶聯物，關于最佳偶聯比，不同研究者的結果有所不同，通常認為半抗原分子與載體蛋白的偶聯比在5∶1～30∶1最佳[21]。試驗通過對合成物的相關因素和相關條件進行正交設計優化后，結果符合推薦范圍。
　　3.4  人工抗原的鑒定方法
　　小分子完全抗原鑒定的方法有很多，如IR、核磁共振碳譜（C13-NMR）、飛行時間質譜法（MALDI-TOF-MS）和標記抗原示蹤法等，IR和C13-NMR可準確測定待測物的化學結構， 但上述方法試驗操作費時、步驟繁瑣、實驗條件要求高、儀器設備購買和使用成本高、同時對操作人員的相關知識結構和操作經驗要求高[22，23]。一般合成初期采用物理學方法（如UV、SDS-PAGE電泳、紅外色譜等）進行初步鑒定[24]，UV法可同時計算偶聯比， 且操作簡單快捷， 被廣泛使用。本試驗從實驗條件，生產實用性和推廣應用等方面考慮， 選用UV作為鑒定人工抗原是否合成成功[25]。雖然理化方法檢驗是必要的，但只有特異抗體的出現才是對全抗原及其合成步驟的最好檢驗，可為Er的多克隆和單克隆抗體的研制、ELISA的建立提供技術基礎。
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