瘧疾診斷技術進展與應用

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　　[摘要]瘧疾是一種嚴重危害人類生命健康的蚊媒傳染病，由于免疫學、分子生物學和生物化學技術的不斷發展，陸續產生一些瘧疾診斷的新技術，本文就瘧疾各種診斷技術的原理和應用作簡要綜述。筆者認為，當前我國處于消除瘧疾監測階段，阻斷病例境外輸入，快速診斷外出回歸人群中的瘧原蟲感染者，及時處置瘧疾疫情是關鍵。在瘧原蟲鏡檢技術的基礎上，實驗室研究著重于DNA探針技術和PCR技術的應用，基層醫療單位和現場監測要推廣應用膠體金免疫層析技術的快速診斷試劑，尤其是杭州艾康和廣州萬孚等國產產品，價格低廉，簡便快速，靈敏度和特異度高，需要盡快普及。
　　[關鍵詞]瘧疾;診斷技術;富組氨酸蛋白一Ⅱ;瘧原蟲乳酸脫氫酶
　　[中圖分類號] R531.3
　　[文獻標識碼]A
　　[文章編號]2095-0616（ 2019） 01-34-05
　　瘧疾是瘧原蟲經按蚊傳播感染人體而引起的一種蟲媒傳染病，嚴重危害著人類的生命健康，被列為全球關注的三大公共衛生問題之一。最近世界衛生組織發布的《2016年世界瘧疾報告》顯示，2016年全球瘧疾控制出現停滯不前現象，有91個國家和地區有瘧疾流行，估計新發病數達到2.16億，較2015年增加約500萬例，其中死亡44.5萬人，與2015年基本持平[1]。因為研究瘧疾防治產生了兩位諾貝爾生理學及醫學獎獲得者，美國科學家羅斯因揭示“瘧原蟲通過按蚊叮咬途徑感染人體”于1902年獲獎，中國藥學家屠呦呦因“創制抗瘧藥青蒿素和雙氫青蒿素，有效降低瘧疾死亡率”而于2015年獲獎。人類對瘧疾防治的研究從不停步，及時、準確的診斷對有效治療瘧疾及控制流行具有重要意義，由于免疫學、分子生物學及生物化學技術的不斷發展，針對瘧疾傳統診斷方法的改進及新的診斷方法陸續產生[2-3]，現就瘧疾診斷技術方面的進展和應用進行簡要綜述。
　　1 非免疫學診斷
　　1.1 臨床診斷
　　以瘧疾發病的臨床特點作為診斷依據：間歇性發作的寒戰、高熱，伴不同程度的頭痛、腰痛、關節痛和肌肉酸痛，口渴狂飲，惡心嘔吐，繼以大汗淋漓、疲乏無力、昏沉入睡而緩解。臨床癥狀可以簡單歸納為冷、熱、痛、渴、汗和睡六個字。我國五十、六十年代初大規模普查普治階段，因顯微鏡和鏡檢人員缺乏而廣泛應用，至今國內外一些條件落后的偏遠農村和跟隨工程遷移而搭建的臨時工棚區仍沿用。一些老疫區居民常常根據這些表現自我診斷、自行服藥治療，由于不正規的治療加上自身免疫力因素，患者轉成無癥狀帶蟲者成為瘧疾的傳染源，同時瘧疾的癥狀無絕對的特異性，與許多發熱性疾病混淆不清而誤診，惡性瘧誤診造成延誤治療病死率高。從流行病學觀點和醫療安全角度來看，在醫學技術、醫療服務快速發展的今天，臨床診斷只能作參考，不宜提倡。
　　1.2 鏡檢法
　　采集患者外周血，涂制厚血膜和薄血膜血片，然后進行溶血染色處理，最后在顯微鏡油鏡頭下查找血膜中是否存在瘧原蟲從而作出診斷，只要鏡檢者經驗豐富，涂片和染色符合要求，鏡檢時仔細認真，血中只要存在瘧原蟲，漏檢幾無可能，具有百年歷史的瘧原蟲鏡檢迄今仍有瘧疾診斷“金標準”的美稱。采集外周血4 - 5μL在載玻片中央偏右涂成直徑0.8 - l.Ocm的圓形厚血膜，取1.0 - 1.5μL外周血于載玻片左1/2 - 1/3位置用推玻片推成寬約2cm的舌狀薄血膜，用記號筆在載玻上寫上受檢者號碼，自然干燥。盡量在48h內，用甲醇固定薄血膜（1- 3min），用蒸餾水對厚血膜進行溶血處理，晾干后用2%吉氏染液浸泡20 - 30min，然后用清水反復漂洗，取出晾干。鏡檢時在厚血膜滴香柏油一滴，用油鏡從自上而下，從左到右，再由右向左，這樣往返不遺漏地查遍整個血膜，薄血膜僅作為原蟲分類時參考檢查[4]。該方法具有檢出率高，可以定蟲種，可以確定原蟲密度，價格低廉，血片可以長期保存等優點，是檢驗其他診斷方法特異度、靈敏度和穩定性的評價標準;但也存在費工費時，對客觀依賴性太強的缺點。
　　1.3 血液棕黃層定量分析法
　　血液棕黃層定量分析（ quantitative buffy coat，簡稱QBC法），創建于1983年，首先由Wardlaw等人將其應用于定量分析血液有形成分，被美國Becton Dickinson公司用于檢查紅內期瘧原蟲并商品化。原理是依據感染瘧原蟲的紅細胞比正常紅細胞輕，比粒性白細胞略重的特性，定量采集末梢血置于裝有抗凝劑（草酸鉀、肝素）、熒光染料吖啶橙和一個與白細胞比重相同的柱形塑料浮子的特制的QBC管中，用封帽蓋住毛細管底端，經10000轉離心5min，將QBC管水平放在專用板上，在熒光顯微鏡高倍鏡下鏡檢，感染瘧原蟲紅細胞濃集于未感染紅細胞和血液棕黃層之間，經熒光染料吖啶橙染色呈桔黃或黃綠色，從QBC管底端起依次為正常紅細胞層、受染紅細胞層（約1mm）、白細胞層（約5mm）、塑料浮子和血漿層，惡性瘧原蟲配子體顯示為彌漫性綠光，間日瘧裂殖體為分葉狀光點，根據光點大小、形狀及染色特點來判斷瘧原蟲的存在[5]。臨床應用結果表明，該法操作容易、快速，檢測一份樣品只需lOmin，且可同時操作多份樣品。QBC法存在的主要問題是成本較高，需要熒光顯微鏡，所使用的QBC管價格昂貴（1.0美元/支），且不能重復使用，雖在實驗室中檢測效果較好，但在現場應用尚不盡如意，因此目前只是作為瘧疾診斷的一種輔助方法。
　　1.4 DNA探針技術
　　人體感染瘧原蟲血液中一定有瘧原蟲核酸（ DNA）的存在。DNA探針技術檢測瘧原蟲就是使用一定的示蹤物對特定基因序列的核酸片段（探針）進行標記，然后通過探針與待測樣本中互補片段的特異性結合，檢測判斷血樣中瘧原蟲DNA的存在[6]。Franzen等[7]1984年首次報告應用DNA探針用基因雜交方法診斷惡性瘧疾。之后該方法不斷改進，其檢測靈敏度、特異度和穩定性大幅度提高。DNA探針直接檢測寄生蟲基因，不僅可以發現原蟲感染，且可以用來鑒別蟲種，不足的是，操作繁瑣，成本較高，還需要使用放射標記，限制了其現場應用。 　　1.5 聚合酶鏈式反應技術
　　聚合酶鏈式反應（ PCR）技術由美國Cetus公司1985年創建，是體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術。通過反復拷貝擴增瘧原蟲的特異性基因片段，增強分析信號，使引物限定的目標DNA片段擴增數百萬倍，樣品中含量極低的目標DNA片段得以檢出，具有很高的特異度及靈敏度。為減少樣品污染，降低操作過程中瘧原蟲DNA的喪失和降解，提高瘧疾檢測的靈敏度，簡化操作過程，PCR診斷技術不斷改進，產生了套式PCR（ NestedPCR） [8-9];之后又不斷出現RCR-雜交法，PCR-RFLP.RAPD等以PCR為基礎的瘧疾檢測方法[10]，應用于瘧疾現場檢測、流行病學調查、實驗室研究等。該檢測技術特異度和靈敏度高，應用前景廣闊，但受限于對實驗條件和技術水平要求較高，投入成本較大。
　　2 免疫學類診斷
　　利用分子免疫學原理生產的，應用于數百種疾病初篩或診斷的試劑盒，以其靈敏度和特異度高，無需大型設備而受醫學界的廣泛歡迎。按其標記方法分為酶標法、熒光標記法、同位素標記法、金屬溶膠標記法、磁顆粒標記法、染料標記法、有色乳膠標記法等，點印漬法和層析試條法還設計出一種試劑可同時測多種分析物的方法。該技術對各分析物可進行定性、半定量甚至定量測定，其發展之快，成果之多，令人目不暇接，由此產生了龐大的產業，成為疾病診斷學界的主流產品。
　　2.1 凝聚法
　　就瘧疾診斷而言，凝聚法中又分為直接血凝法（ DAT）和間接血凝法（IAT）兩類。DAT系把具有瘧原蟲抗原的溶胞液包被在聚苯乙烯乳膠珠上，再按10：1的體積加入被檢人血清，再在各種NaCI濃度（0 - 300mM）下計算凝集時間，并按特定公式計算出感染程度，由于誤差較大，準確率較低，應用價值有限。IAT則把抗原結合于乙醛固定的0型紅細胞，加入被檢人血清，其中若存在針對此抗原的抗體，就會發生凝聚而被檢出，此法操作簡易，但靈敏度和特異度較差，只能作為輔助診斷工具。
　　2.2 酶聯免疫吸附法（ EIISA）
　　此法系利用包被單抗（或多抗）/全血中所含抗原/標記單抗（或多抗）這三者能特異性結合，形成三元復合物而被檢出的方法。該方法靈敏度可與鏡檢法相當，特異度高、可同時檢測多個樣品;存在的問題是必須由專業人員操作，而操作又極繁瑣，需逐一有序地加入全血、標記單抗、底物、終止液等試劑，中間還有多次清洗操作，耗時較久，一次試驗要2h以上。
　　2.3 免疫點印漬法
　　免疫點印漬法的原理和ELISA法相同，只是作了一些改良，即用硝酸纖維素等濾膜替代96孔塑料板，這種改動不僅靈敏度和特異度與ELISA法相當，減少了操作步驟，防止了ELISA法中因甩打式洗板方式造成的環境污染，而且全程僅需lOmin，深受用戶歡迎。但由于該法應用與免疫層析技術相比遜色不少，故雖有論文報道，但無實際產品上市。
　　2.4 免疫層析法檢測
　　膠體金免疫層析技術的原理是在硝酸纖維素膜上包被瘧原蟲特異性單克隆抗體作為捕獲帶，然后用膠體金標記同一抗體，層析過程中標記抗體與捕獲到瘧原蟲抗原通過捕獲帶時發生顏色反應，即可判斷存在瘧原蟲感染。瘧原蟲乳酸脫氫酶（ PIDH）和惡性瘧原蟲特有的富組氨酸蛋白一Ⅱ（HRP-Ⅱ）是目前常用的檢測靶抗原，傳統瘧疾膠體金診斷試盒主要以HRP-Ⅱ為檢測靶點，只能檢出惡性瘧;目前應用最廣泛的是以PLDH為檢測靶點的瘧疾膠體金診斷試劑盒，既能檢測惡性瘧和間日瘧又能檢測出卵形瘧。目前國際上應用較多的有Para sight-F試劑盒、ICT Malaria P.f&P.f/P.v診斷試劑盒、Opti MALR試劑盒、Binax NOW⑩試劑盒、Care Start瘧疾HRP-Ⅱ/PLDH復合試劑盒;國內應用較多的有杭州艾康P.f/P.v試劑盒和廣州萬孚瘧原蟲檢測試劑盒等。
　　2.4.1 Para sight-F試劑盒 美國BectonDickinason公司生產，為世界衛生組織推薦使用的惡性瘧原蟲快速診斷試劑之一。利用特異的單克隆抗體來檢測惡性瘧原蟲HRP-Ⅱ，從而判斷檢測血樣中惡性瘧原蟲的存在。其說明書聲明原蟲密度大于60個/μL血時，與鏡檢法比較檢出惡性瘧的靈敏度和特異度分別為96.5%- 100.0%和81.1% - 98.7%，原蟲密度下降靈敏度下降，與楊亞明等[11]使用Para sight-F試劑盒在云南西南部檢測187例疑似惡性瘧患者結果一致。
　　2.4.2 ICT Malaria P.f/P.v診斷試劑盒 為澳大利亞Austcard公司產品，以HRP-Ⅱ為檢測靶物，原理為在硝酸纖維素膜分別包被特異性的惡性瘧HRP-Ⅱ單克隆抗體和pan-malaria antigen（ PMA）單克隆抗體，可同時檢測惡性瘧和間日瘧。張再興等[12]在云南用該試劑檢測結果顯示惡性瘧和間日瘧靈敏度為85.71%和69.57%，惡性瘧和間日瘧的特異度分別為99.12%和99.12%，與國內外相關報道結果接近。
　　2.4.3 0pti MALR診斷試劑盒 由美國俄勒岡Flow Inc公司生產，以PLDH為檢測靶抗原。王真瑜等[13]檢測云南流行區瘧疾患者血樣200份及上海健康者血樣60份進行比較分析，Opti MAL檢測總體靈敏度和特異度為95.5%和100.0%，惡性瘧、間日瘧的靈敏度和特異度分別為90.0%、96.0%和99.4%、97.5%，均高于CICA試劑，與國內周升等[14]用Opti MAL檢測結果相近。Iqbal A等[l5]1997年在科威特用Opti MALR診斷試劑盒檢測550例發熱患者，結果顯示當蟲體密度達100個/μL以上時，靈敏度與PCR、鏡檢方法檢測性能相近為97%;原蟲密度降低時，靈敏度下降到59%。國內外研究靈敏度存在差異，是否與地域蟲種及感染密度有關有待進一步研究。 　　2.4.4 Binax NOWR診斷試劑盒 系美國InvemessMedical Innovation公司研制，診斷靶抗原為HRP-Ⅱ和醛縮酶（AID），ALD是所有瘧原蟲含有的特異性蛋白，該試劑可區分惡性瘧和其他3種瘧原蟲。楊永昌等[16]應用該試劑盒對利比亞維和二級醫院疑似患者131例進行檢測并與鏡檢法比較，鏡檢法檢出陽性34例，其中惡性瘧33例，間日瘧l例，Binax NOWR試劑盒檢出惡性瘧32例，間日瘧1例，陰性符合率100%，陽性符合率97.06%，總符合率99.2%。與劉慧等I”]使用Binax NOWR試劑盒在中緬邊境地區檢測結果一致。
　　2.4.5 Care Start瘧疾HRP-Ⅱ/PLDH復合試劑盒 由美國Access Bio公司研制，同時在硝酸纖維素膜上包被兩種單克隆抗體于測試條兩側，分別特異性捕獲瘧原蟲乳酸脫氫酶（ PIDH）和惡性瘧原蟲的富組氨酸蛋白一Ⅱ（HRP-Ⅱ），該診斷試劑盒專用于惡性瘧和其他型瘧疾的鑒別診斷。張勇等[18]使用該試劑盒與鏡檢法對103例瘧疾、疑似瘧疾進行檢測對比分析，兩方法檢出陽性率沒有統計學差異，該試劑的靈敏度和特異度分別為95.65%和97.50%。與孫曉東等[19]使用Care Start瘧疾HRP-Ⅱ/PLDH復合試劑盒在中緬邊境地區對疑似瘧疾患者進行檢測結果基本一致。
　　2.4.6 艾康P.f/P.v試劑盒 由我國杭州艾康生物技術有限公司研制，是最早投入使用的國內產品，通過在硝酸纖維素膜上包被兩種特異性單克隆抗體來檢測靶抗原HRP-Ⅱ和PLDH，判定瘧原蟲感染種類。孫曉東等[20]與王光澤等[21]應用艾康瘧疾診斷試劑盒分別在云南和海南檢測結果非常接近，總體靈敏度分別為92.56%和99.4%，特異度分別為98.57%和98.9%;惡性瘧檢測靈敏度分別為100%和100%，特異度分別為98.57%和99.3%;間日瘧檢測靈敏度分別為86.96%和98.8%，特異度分別為100%和100%。表明艾康瘧疾診斷試劑盒能鑒別診斷惡性瘧和間日虐，靈敏度和特異度比國外同類產品還好，并且價格低廉，非常適合鏡檢技術和條件不足的國內基層醫療單位、預防機構開展瘧疾檢測。
　　2.4.7 萬孚瘧疾診斷試劑盒 由我國廣州萬孚生物技術有限公司生產，在硝酸纖維素膜上檢測區預先包被固定pfLDH和panLDH單克隆抗體，在質控區固定抗鼠IgC多克隆抗體，結合墊固定有panLDH單克隆抗體膠體金標記物。通過捕獲全血樣品中特異性惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）和瘧原蟲乳酸脫氫酶（ panLDH），結合檢測過程中硝酸纖維素膜上質控區是否出現膠體金標記物panLDH抗體與抗鼠IgG多克隆抗體反應線來判定樣本量是否足夠，層析過程是否正常，綜合判定是否存在惡性瘧感染、惡性瘧與其他瘧原蟲混合感染，惡性瘧以外的其他瘧原蟲感染。魏容等[22]對86例2012年5月- 2016年5月間接診的疑似瘧疾患者利用萬孚瘧原蟲檢測試劑盒檢測并與鏡檢法對比，其檢測靈敏度為100%，特異度為97.43%，與鏡檢法相比無顯著性差異，與薛成軍等[23]2009年10月- 2010年7月在蘇丹維和期間檢測236份發熱患者的結果一致。該方法具有操作簡便，檢測速度快，技術要求低且價格低廉等優勢，適用于基層醫院和大規模普查。
　　3 小結
　　綜上所述，臨床診斷從流行病學和醫療安全角度出發不宜提倡，僅供參考。鏡檢法作為瘧疾診斷的金標準沿用至今，有著其他診斷方法不可替代的優勢，特異度高，可直接鑒別蟲種及原蟲不同發育時期，可以確定原蟲感染密度，對患者治療有指導作用，而且成本低廉。QBC法雖然操作簡易快捷，但需要價格昂貴的熒光顯微鏡和QBC管，很難推廣。以分子生物學為基礎的DNA探針技術和PCR技術，檢測靈敏度和特異度高，且能鑒別蟲種，但操作繁瑣，對實驗室條件和技術水平要求較高，儀器昂貴，成本高，主要適用于實驗室研究?；诜肿用庖邔W原理的瘧疾診斷試劑盒，因其快速簡便，無需大型設備而廣受歡迎。其中凝聚法由于靈敏度和特異度不高而應用受限，ELISA法因操作繁瑣而難于推廣，免疫點印漬法則因綜合性能競爭不過免疫層析法而沒有產品上市。膠體金免疫層析技術生產的瘧疾診斷試劑盒，因其靈敏度和特異度高，性能穩定，操作簡便快速，對實驗條件和技術水平要求不高，適合在基層醫療機構和現場工作中廣泛應用。相對于國產的杭州艾康、廣州萬孚瘧疾診斷試劑盒，Para sight-F試劑盒、ICT Malaria P.f/P.v試劑盒、OptiMAL試劑盒、BinaxNOW試劑盒、CareStart瘧疾HRP-Ⅱ/pLDH復合試劑盒等國外產品，其共同缺點是價格比較貴。我國已進入消除瘧疾監測階段，2017年還實現了無本地感染目標，阻斷境外輸入瘧疾病例是當務之急，應大力推廣普及國產試劑盒在基層醫療機構的應用，針對日益增多的到非洲和東南亞務工、經商、旅游回歸人員進行快速瘧原蟲檢測，及時準確地診斷出瘧疾患者并開展流行病學調查和處置。其他國家和地區可根據當地的疫情形勢、經濟狀況和社會條件，選擇一種或幾種準確有效的瘧疾診斷方法應用于瘧疾防治的現場和研究工作。
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