鐵棒錘種子蛋白質提取及聚丙烯酰胺凝膠電泳研究
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摘要：目的 構建適合鐵棒錘種子蛋白質研究的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）體系，為鐵棒錘種子純度檢測及鑒別研究提供技術支撐。方法 采用6種蛋白質提取法提取伏毛鐵棒錘種子蛋白質，并篩選出最佳提取方法，在此基礎上研究不同分離膠濃度、料液比、上樣量對伏毛鐵棒錘種子蛋白電泳分離效果的影響，并采用篩選出的蛋白質最佳提取分離方法對鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子進行鑒定。結果 巰基乙醇法提取的伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳圖譜效果較佳，電泳譜帶數最多（14條）、最清晰，適合于其種子純度檢測;分離膠濃度為15%、料液比為1∶10（M/V）、蛋白上樣量稀釋5倍時，其種子蛋白質電泳分離效果較好;鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳圖譜在蛋白質譜帶位置和強弱上有一定差異。結論 本研究建立的鐵棒錘種子蛋白樣品制備方法及SDS-PAGE技術可用于鐵棒錘種子純度檢測，其蛋白質圖譜可作為鐵棒錘與伏毛鐵棒錘種子的鑒別依據。
關鍵詞：鐵棒錘;種子;聚丙烯酰胺凝膠電泳;蛋白質提取;鑒定
中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2019）06-0064-06
Abstract： Objective To establish the appropriate SDS-PAGE system for study on protein from Aconitum pendulum Busch. seeds; To provide technical support for the purity detection and identification of Aconitum pendulum Busch. seeds. Methods Six protein extraction methods for Aconitum pendulum Busch. seeds were tested， and the best extraction method was selected out. Based on the optimal extraction method， the effects of different separation gel concentrations， solid-liquid ratios and sample loadings on the electrophoretic separation of protein from Aconitum pendulum Busch. seeds were studied. The optimal protein extraction and separation method was used to identify seeds of Aconitum pendulum Busch. and Aconitum flavum Hand. Mazz. Results The electrophoresis pattern of Aconitum flavum Hand. Mazz. extracted by thiol ethanol method was better， and the electrophoresis band number was the most （14） and the clearest， which were suitable for its seed purity detection. When the concentration of separation gel was 15%， the ratio of material to liquid was 1：10 （M/V）， and the amount of protein sample was diluted by 5 times， the separation effect of seed protein was better. The electrophoresis patterns of Aconitum pendulum Busch. and Aconitum flavum Hand. Mazz. had some differences in the position and strength of the protein bands. Conclusion The developed methods of seed protein extracting and SDS-PAGE electrophoresis technique can be used for seed purity detection， and the protein fingerprints can be applied to identify seeds of Aconitum pendulum Busch. and Aconitum flavum Hand. Mazz.
Keywords： Aconitum pendulum Busch.; seed; SDS-PAGE; extraction of protein; identification
鐵棒錘為毛茛科植物鐵棒錘Aconitum pendulum Busch.和伏毛鐵棒錘Aconitum flavum Hand. Mazz.的干燥塊根和幼苗，收載于《中華本草·藏藥卷》[1]，具祛瘀活絡、止血鎮痛等功效，臨床常用于跌打損傷、風濕性關節痛、骨折等的治療，療效顯著[2-3]。
近年來，隨著市場需求的增加，鐵棒錘野生資源急劇下降，開始由野生轉為人工栽培，其繁殖方式主要是種子繁殖[4]，故種子的檢驗是保證種子質量的重要措施，也是保證藥材品種和質量的重要前提[5]。種子所含蛋白的種類和數量攜帶了其長期演化的遺傳特征，具有很高的穩定性、專屬性。而種子蛋白電泳技術具有不需將種子萌發、送檢樣品可及時分析等優點，已廣泛應用于植物和農作物的純度測定、品種鑒定和親緣關系分析[6]，在中藥材種子鑒別、品種純度測定方面也開始應用[7-9]。目前有關鐵棒錘種子的研究主要集中在化學成分及品質方面[10-11]，其種子蛋白研究尚未見報道，因而利用電泳圖譜鑒定鐵棒錘種子純度的方法值得探究。本試驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術研究鐵棒錘種子蛋白質提取的最適宜方法和電泳條件，建立適用于其種子鑒別的SDS-PAGE技術體系，為鐵棒錘種質資源的保護、評價、種子鑒定、純度測定提供依據。 1 儀器與試藥
DYY-10C型電泳儀（北京市六一儀器廠），DYCZ-23A型垂直電泳槽電泳槽（北京市六一儀器廠），TGL16M型高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司），BX7200HP型超聲波清洗器（上海新苗醫療器械制造有限公司）。
鐵棒錘種子于2017年10月收集于甘南州合作市鐵棒錘種植基地，伏毛鐵棒錘種子于2017年10月收集于甘肅省臨夏回族自治州和政藥用植物園，經杜弢教授鑒定，分別為鐵棒錘Aconitum pendulum Busch.和伏毛鐵棒錘Aconitum flavum Hand. Mazz.的種子。三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甲叉雙丙烯酰胺（Arcy/Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、巰基乙醇、溴酚藍、甘油、冰醋酸、丙烯酰胺、考馬斯亮藍G250，天津市大茂化學試劑廠;過硫酸銨（APS），煙臺市雙雙化工有限公司。
2 方法與結果
2.1 溶液配制
2.1.1 濃縮膠緩沖液
精密稱取6 g Tris，加入約60 mL蒸餾水，用1 mol/L鹽酸調pH值至6.8，蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，4 ℃冰箱保存備用。
2.1.2 分離膠緩沖液
精密稱取18.15 g Tris，加入約60 mL蒸餾水，用1 mol/L鹽酸調pH值至8.8，蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，4 ℃冰箱保存備用。
2.1.3 樣品緩沖液
精密吸取濃縮膠緩沖液1.0 mL、50%甘油0.8 mL、10%SDS 1.6 mL、TEMED 0.4 mL、0.05%溴酚藍0.2 mL、蒸餾水4.0 mL于試管中，搖勻，備用。
2.1.4 電極緩沖液
精密稱取Tris 3.03 g、甘氨酸14.4 g、SDS 1.0 g，溶入900 mL蒸餾水，定容至1000 mL容量瓶中，搖勻，4 ℃冰箱保存備用。
2.1.5 10%、12%、15%分離膠溶液
按表1順序加入試劑，立即混勻，備用。
2.5 蛋白質含量測定
2.5.1 考馬斯亮藍溶液制備
精密稱取100 mg考馬斯亮藍G250，溶于90%乙醇50 mL中，加入85%（W/V）磷酸100 mL，再用蒸餾水定容到1 L容量瓶中，搖勻，過夜后過濾，濾液貯藏于棕色瓶中，室溫保存。
2.5.2 牛血清蛋白標準溶液制備
精密稱取牛血清蛋白25 mg，加蒸餾水溶解后定容至100 mL容量瓶中，再從中吸取40 mL，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，置4 ℃冰箱存放，備用。
2.5.3 供試品溶液制備
精密稱取伏毛鐵棒錘種子粉末0.2 g，按“2.2”項下方法提取蛋白質，將提取出的蛋白質溶液定容至10 mL容量瓶中，搖勻，作為貯備液。精密吸取0.2 mL貯備液至具塞試管中，加入0.8 mL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍溶液，搖勻，備用。
2.5.4 含量測定方法
按表2配制濃度為0、20、40、60、80、100 ?g/mL系列對照品溶液，搖勻，放置2 min，在595 nm波長處比色測定，以吸光度（Y）對牛血清蛋白含量（X）進行回歸處理，得回歸方程：Y=0.011 6X+0.016 9（r2=0.999 1）。
2.6 料液比對伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳的影響
采用巰基乙醇法提取伏毛鐵棒錘種子蛋白質，料液比分別設為1∶10、2∶10、3∶10、1∶15、1∶20、1∶25，電泳結果見圖2。
2.7 上樣量對伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳的影響
采用巰基乙醇法提取伏毛鐵棒錘種子蛋白質，吸取蛋白質提取液40 ?L，用樣品緩沖液稀釋3～12倍，電泳結果見圖3。
2.8 鐵棒錘種質鑒定
采用巰基乙醇法、15%分離膠、1∶10料液比、蛋白質提取液稀釋5倍上樣量進行鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳圖譜比較，結果見圖4。
由圖4可以看出，鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳譜帶在著色度和位置上存在差異：伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳譜帶較鐵棒錘清晰，泳道背景較深;伏毛鐵棒錘種子蛋白質在電泳第二段中間多了一條帶，鐵棒錘種子蛋白質電泳在電泳第二段與第三段中間多了一條帶（圖中箭頭所示）。因此，可根據這2條特征譜帶鑒別鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子。
3 討論
本試驗對溶液配制時間及貯存溫度要求較高，如SDS需要在室溫條件下保存，其他配制溶液需在4 ℃冰箱保存，10%APS則需現配現用，所有試劑配制后貯存時間超過1個月則嚴重影響電泳圖譜效果，故需嚴格控制所配溶液使用時間。
蛋白質電泳圖譜清晰程度和譜帶分離效果與分離膠和濃縮膠有一定關系，如分離膠凝固不完全則譜帶分離不清晰，濃縮膠凝固不完全則梳子很難取出，點樣困難，進而影響譜帶分離，故在制膠過程中需保留足夠時間凝膠，再進行后續試驗。
6種提取方法所得伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳結果顯示，巰基乙醇法和丙酮沉淀法提取的伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳圖譜效果好，SDS-PAGE電泳譜帶數最多、最清晰，其譜帶數為14條，但丙酮沉淀法由于沉淀種子蛋白質的量較大，在上樣時需要稀釋次數多，步驟較巰基乙醇法繁瑣，故最適宜的蛋白質提取方法為巰基乙醇法。
電泳相關因素對伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳效果影響的研究結果表明，不同料液比、上樣量及分離膠濃度對種子蛋白質電泳圖譜的影響很大。在種子量保持不變情況下，提取液太少或太多都會影響譜帶的分離及清晰度;提取液稀釋倍數太少或太多也會影響譜帶的分離及清晰度;高濃度分離膠較低濃度分離膠更有利于種子蛋白質的分離。 鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子蛋白質電泳圖譜結果表明，二者種子蛋白質電泳譜帶在位置和著色度方面存在差異，可根據存在的特征譜帶鑒別鐵棒錘和伏毛鐵棒錘種子。
綜上所述，本試驗建立的SDS-PAGE電泳方法經濟、適用、可行，可用于鐵棒錘種子純度檢測及種質鑒定。本研究結果對鐵棒錘種質資源的保護、評價、種子鑒定、純度測定及育種具有重要意義。
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（收稿日期：2018-07-27）
?。ㄐ藁厝掌冢?018-08-13;編輯：陳靜）
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