核桃內果皮木質素生物合成途徑關鍵基因研究進展
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摘要：木質素（Lignin）是陸生維管植物次生細胞壁中含量豐富的高分子有機化合物，與植物細胞壁內的纖維素和半纖維素交織在一起。木質素在核桃硬殼（內果皮）中含量豐富且是其構成的主要成分，含量約在60%以上，目前生產中核桃縫合線松弛以及核桃內果皮發育不全（露仁）現象成為制約新疆核桃優質高產的主要因素，新疆要實現核桃的優質高產以及木質素的充分合理的利用，需進一步了解木質素的結構、組成及關鍵基因表達調控。因此，重點對木質素結構、木質素生物合成過程及基因調控規律等方面分析基因調控規律，為從植物木質素合成及表達量方面改善新疆核桃品質奠定理論基礎。關鍵詞：核桃;木質素;生物合成途徑;調控基因
核桃（Juglans regia L）在中國資源豐富且栽培歷史悠久，因其富含蛋白質、脂肪、碳水化合物等人體所必需物質及鐵、鋅、錳等多種微量元素，對于延緩人體衰老、心血管的保健作用、預防慢性疾病等具有非凡意義，有著極佳的保健效果和藥用價值，在國內、國際市場均具有巨大的消費潛力。新疆得天獨厚的自然生態條件使其是我國核桃重要產區之一，伴隨著核桃種植面積及品質的綜合發展，培育出仁率高、易機械脫皮適于深加工的核桃品種是當前核桃育種及品種改良的主要目標之一。其中新疆珍稀核桃種質‘溫138’平均出仁率高達83.2%，產量極高、果殼極薄、極易脫皮，但殼面（內果皮發育不完整或部分退化）開裂導致露仁，是珍貴的遺傳育種資源。
研究表明，核桃內果皮的主要組分是木質素（Lignin），木質素是陸生維管植物適應環境的進化特征之一，同時也是構成其細胞壁的主要成分之一，主要存在于植物木質化程度高的硬組織中與纖維素、半纖維素等多糖分子通過氫鍵、共價鍵等作用相互交聯在一起，通常起到增強細胞壁的沉積、提高細胞壁機械強度及硬度的作用，具有較強的不滲水性，對病原體具有保護的作用，其穩定性較高從而使得植物細胞壁具有抗氧化、阻燃、機械支持及生物防御等功能。木質素的物理及化學性質也使得植物體具有防止蟲害和病原體侵入的作用。植物體木質素生物合成途徑及調控是一個復雜的過程，目前關于木質素單體合成途徑已基本清晰，但木質素聚合機理仍未系統闡述清楚。本文從木質素結構、木質素生物合成過程及基因調控規律等方面分析基因調控規律，以期從分子育種途徑調節核桃內果皮木質素生物合成途徑中關鍵基因，為進一步改良核桃果實品質提供理論依據。
1核桃內果皮研究
核桃由內果皮（硬殼）和種仁組成，內果皮作為核桃重要組成部分，具有比表面積和孔隙率大、機械強度高、可再生和降解等優點，在核桃果實發育、加工及貯藏中均起著重要作用。目前對核桃內果皮結構（縫合線緊密度、厚度、機械強度）與種仁商品品質的關系研究較多，及內果皮做吸附劑吸附重金屬獲染料的研究較多。
研究表明，核桃內果皮最主要組分為木質素（GS型木質素，其中G型木質素高達80.68%），內果皮越厚核桃縫合線越緊密，且硬殼厚度與堅果質量存在極顯著的正相關關系，與出仁率存在極顯著的負相關關系。近年來通過研究核桃內果皮（包括核桃殼粉）對Cu2+、As3+、Cr6+、pb2+等金屬離子分別進行直接吸附、活性吸附劑等吸附試驗，發現通過物理化學方法活化后吸附量比直接做吸附劑的效果好，其吸附性均對金屬離子均具有選擇吸附性。
2木質素結構
木質素是具復雜三維網狀芳環結構的酚類高分子聚合物，是一種珍貴難降解的天然可再生資源且含量高。其相對含量達生物質的1/3左右且能量最高。通過氫鍵、酯鍵、醚鍵、范德華力等共價鍵與非共價鍵的共同作用，與纖維素、半纖維素連接并交織在形成復合體，在植物中起到抵抗壓力、硬化細胞壁、增強植物體的機械強度的作用，但很難造成分離純化木質素。
木質素是植物體內含有大量醇羥基、酚羥基、羰基等活性基團的復雜天然大分子，其含碳60%、氧30%、氫6%及氮0.67%左右，同時具備糖及酚的特點，因此反應類型十分豐富，能與不同物質發生不同化學反應。木質素主要由對一羥基苯基木質素（bydroxy-phenyllignin，H-木質素）、愈創木基木質素（guaiacyl lignin，G-木質素）和紫丁香基木質素（syringyl lignin，S-木質素）3種木質素單體亞單位構成，分別來自香豆醇（p-coumaryl alcohol）、松柏醇（coniferyl alcohol）和芥子醇（sinapyl-alcohol）3種苯丙烷。其中香豆醇結構中沒有甲氧基基團，芥子醇比松柏醇多了一個甲氧基基團且芥子醇無游離的C-5，導致不能與其它單體形成較穩定的C-C連接，因此S-木質素結構疏松在木質素分離時較G和H型木質素易被去除。通常20多種化學鍵連接在一起構成木質素單體，隨著木質素相關研究的深入，發現植物體木質素的構成不僅由這3種木質醇組成，還有木質醇的不完全生物合成過程中生成的5-羥基松柏醇、羥基肉桂醛、羥基肉桂酸等單體也參與了木質素的聚合過程，且在植物中發現錳過氧化物酶（MnP）、漆酶（L）、漆酶/木聚糖酶體系（LXS）、漆酶/介體體系（LMS）等可直接降解木質素。
3木質素生物合成途徑
木質素生物合成途徑通常由羥基化、連接反應、甲基化、氧化還原反應、聚合反應等復雜過程交互完成，由于植物自身發育、外界環境的影響，加之一些未知酶或基因對木質素生物合成造成影響或修正原有功能及作用，目前木質素基本合成過程中木質素單體的合成、貯藏、運輸及木質素單體脫氫羥化聚合為木質素的過程還不是完全清楚。經過木質素方面多年的研究基礎，發現木質素單體生物合成途徑首先是二氧化碳在植物光合作用下產生的葡萄糖經酶促反映生成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸的莽草酸途徑，這是植物體、細菌及真菌特有的代謝途徑;其次是苯丙氨酸經過脫氨基、甲基化、羥基活化等過程到反式-4-羥基肉桂酸（HCA）及其輔酶A脂類化合物的苯丙烷代謝途徑;最后是對羥基肉桂酸（HCA）及其輔酶A脂類化合物氧化還原為木質素單體，再進一步強化脫氫聚合生成木質素的木質素合成特異途徑。 木質素生物合成途徑主要包括苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，簡稱PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，簡稱C4H）、肉桂酸-3-羥基化酶（Coumaric acid 3-hydroxylase，簡稱C3H）、咖啡酸-O-甲基轉移酶（Caffeic acid O-methyl-transferase，簡稱COMT）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate CoA ligase，簡稱4CL）、阿魏酸-5-羥基化酶（Ferulic acid 5-hydroxylase，F5H）、莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶（Shikimate/Quinate hydroxycin-namo訂transEerase，簡稱HCT）、咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶（Caffeoyl-CoA O-methyltransferase，簡稱CCoAOMT）、對羥基苯乙烯酰輔酶A-3-脫氫酶（Coumaroyl-CoA3-Hydroxylase，簡稱CCoA3H）、肉桂酰輔酶A還原酶（CinnamoyI-CoA reductase，簡稱CCR）、肉桂醇脫氫酶（Cinnam訂alcohol dehydrogenase，簡稱CAD）等參與。目前苯丙烷代謝途徑和木質素合成途徑占據木質素生物合成過程重要地位但其相關研究還不夠深入徹底，也因此這兩種途徑成為國內外專家學者在木質素方面的研究熱點。
4木質素合成途徑中關鍵調控基因
木質素生物合成途徑及其調控過程復雜，根據其途徑中關鍵酶調控效果可分為3類：（1）苯丙烷代謝途徑調控基因，主要由PAL（苯丙烷類代謝途徑首個限速酶）、C4H（細胞中起結構支架作用的單氧化酶）及4CL（連接木質素前體及各個分支反應的關鍵酶）參與調控;（2）木質素特異合成途徑上游基因調控，主要由Call（控制木質素代謝過程H-單體向G/S-單體轉化的關鍵酶）、COMT（參與C5位置甲基化的重要甲基化酶）、CCoAOMT（參與芳香環上羥基的甲基化酶）、FsH（CYP84家族決定S一木質素前體的限速酶）參與調控;（3）木質素單體特異合成途徑下游基因調控，下游調控基因由CCR（控制木質素合成及微纖夾角）和CAD（木質素生物合成中最后一步關鍵催化反應酶）組成。
4.1苯丙烷代謝途徑調控基因
PAL存在于多數綠色植物和少數細胞細菌、真菌和藻類中，在植物體內苯丙烷代謝途徑中催化苯丙氨酸脫氨生成氨和反式肉桂酸，對細胞分化、木質化過程、抗旱、抗寒、抗病蟲害等方面均起到重要作用。Korth等在轉基因煙草中上調PAL基因，木質素含量及PAL的活性均增加;鄒麗紅等在砂梨研究中抑制PAL活性降低了木質素含量及石細胞含量，但并未改良砂梨果品品質。C4H是細胞色素P450家族CYP亞家族中的一種單氧化酶，在細胞中起著結構支架的作用，Sewalt等對轉基因煙草研究中發現抑制C4H表達會導致植物體內S/G值下降，木質素含量出現降低同時其構成改變，但植株生長正常未出現異常;Blee K等在煙草研究發現中發現抑制植株中C4H活性，S/G比值出現顯著降低且木質素的含量明顯下降，植物生長正常未出現異常。通過對4CL序列分析發現4CL基因主要從玉米、水稻等單子葉植物和擬南芥、煙草等雙子葉植物中被克隆出來，隨后研究發現4CL在植物體內主要以基因家族的形式存在，位于苯丙烷類及其衍生物生物合成的關鍵點上。倪志勇等在擬南芥、煙草、白楊、毛白楊等植物的研究中發現，抑制4CL基因表達會引起植物體內木質素含量顯著降低，其中S/G比值卻會根據植物種類的不同而有所差異，在擬南芥植株中G-木質素的含量顯著降低，在煙草植株中S-木質素的含量顯著降低，而在白楊中植株S/G卻沒有明顯變化。綜上所述，下調這4種酶活性或抑制基因表達，植株體內木質素含量顯著降低。
4.2木質素特異合成途徑上游基因調控
C3H是細胞色素P450 CYP98A3基因家族之一，在植物木質素代謝過程中主要調控H單體向G、S單體轉化。Reddy等對苜蓿反義抑制研究中發現降低C3H活性木質素含量沒有明顯變化，但H單體相較G、S單體其含量顯著增加;Coleman等研究發現降低C3H基因表達，S/G比值也顯著增加（木質素總含量顯著下降）;Ralph J等降低白楊中C3H基因表達，木質素總量降低為原來的一半，其中G-木質素和S-木質素含量均下降，但是原本含量較低的H-木質素則顯著增加的現象。COMT植物體內主要起到合成和調控S-型木質素的作用。通過研究發現，抑制玉米、銀合歡、紫花苜蓿等植物中COMT活性，木質素含量均出現明顯下降現象。Lapierre等研究轉基因白楊、高羊茅等植物發現，調控COMT一般只影響S/G比值，木質素含量變化不明顯，只有在高水平抑制表達時才能起到降低木質素總含量的作用。CCoAOMT比COMT發現的晚些，主要參與S/G-型木質素的合成及調控作用。最早對擬南芥、苜蓿等植物研究發現，抑制CCoAOMT的表達木質素含量明顯降低同時其組分發生改變;在抑制甜蕎、桉樹等植物中CCoAOMT基因的表達，能顯著降低木質素含量，其中甜蕎中CCoAOMT基因表達量與木質素含量呈顯著正相關;在亞麻、楊樹等植物中抑制CCoAOMT基因的表達，木質素含量不僅降低同時伴有植株生長畸形、木質部結構發生變化等現象。其中反義共轉化COMT、CCoAOMT基因表達，使轉基因煙草植株木質素含量下降幅度更大，說明存在協同效應及交叉作用。F5H在植物體中起限制S一型木質素合成的作用，通過調控F5H基因的表達雖然不能起到降低木質素總含量的作用，但過量表達F5H基因導致S-型木質素單體含量增加（S/G比值增大），使的木質素更易于從植物體內去除。調控上述3種酶活性不僅起到降低植物木質素含量的作用且起到改變木質素組分的作用。
4.3木質素單體特異合成途徑下游基因調控
CCR催化3種羥基肉桂酸輔酶A酯生成相應肉桂醛，緊接著CAD通過NADPH將3種肉桂醛通過氧化還原反應催化生成3種對應的肉桂醇，對其展開的相關研究相對較早。Relph等（1998）研究發現，抑制CCR的表達使植物體內木質素總含量顯著下降，且組分會發生相應改變。研究發現降低轉基因楊樹（Populus tremula×Populus alba）、玉米、黑麥草中CCR的活性，植株中木質素總體含量將會降低甚至到原來含量的一半，植株的表型出現異常且生長活力不足。研究發現在擬南芥、楊樹、甜蕎等植物中降低CAD基因的表達量往往伴隨著木質素含量降低或影響木質素單體的組成，植株表現型通常正常。
5木質素研究問題與展望
通過近年來的不斷探索目前已研究開發出上百種的木質素產品，但是由于木質素結構復雜多變、化學成分尚不完全清楚、化學性質極不穩定等因素制約，我們對木質素的空間結構和代謝途徑了解還不透徹，目前只有少數植物中的木質素建立了結構模型，可能還有很多與木質素相關的基因沒有被發現，關于核桃露仁現象及與之相關核桃內果皮硬化過程中木質素沉積的系統分子機理尚不清楚，如何深挖露仁核桃資源在生產加工、遺傳育種上的應用潛能，加強新疆特有露仁核桃種質資源的保存與保護，深層次發揮露仁優良基因在新疆高品質露仁核桃育種中的實踐價值，是當前核桃育種基礎研究和生產實踐中亟需解決的問題。通過克隆得到木質素生物合成途徑中關鍵基因并加以調控，從而起到改變植物體木質素含量及其組分的相關研究也成為近幾年研究的熱點。在基因調控方面，人們在不同植物克隆并獲得木質素含量改變植株，目前核桃（Juglans regia）全基因組測序已完成，深入研究核桃內果皮木質素代謝途徑相關基因的功能、核桃硬核期基因調控方面提供理論基礎，可以為今后開展核桃遺傳圖譜構建、分子標記輔助選擇和品質改良、重要性狀基因的克隆與功能驗證等分子育種工作打好基礎。
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