‘云香’水仙NtNAC1基因的克隆及功能分析

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　　摘  要  本研究利用RT-PCR技術從‘云香’水仙的根中克隆得到了NtNAC1基因，并通過qRT-PCR技術分析了該基因的時空表達模式以及在逆境和逆境相關激素處理下的表達變化，結合分析過表達該基因的轉基因煙草植株的表現等解析了該基因的功能。結果顯示：NtNAC1基因全長1083 bp，其ORF為918 bp，編碼306個氨基酸，N端含有NAM保守結構域，聚分在SNAC1亞組，與香蕉MusaSNAC1、小麥TaNAC47親緣關系較近。實時熒光定量分析顯示，NtNAC1的表達水平隨花器官花瓣和副冠的發育呈先上升后下降趨勢，始花期達到峰值;NtNAC1在根和葉中高表達，受ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG誘導上調，推測該基因可能參與‘云香’水仙花器官的形態建成及響應非生物脅迫。進一步構建表達載體轉化煙草，獲得9株轉基因植株。在高鹽和干旱脅迫處理下，轉基因植株根系發達、長勢更好、存活率高，表明水仙NtNAC1過表達能提高煙草對高鹽、干旱的耐受性，在抗逆中起正向調控作用，可作為提高水仙抗性的優良遺傳基因資源。
　　關鍵詞  ‘云香’水仙;NAC轉錄因子;非生物脅迫;功能分析
　　中圖分類號  S682.2+1      文獻標識碼  A
　　Abstract  NtNAC1 was cloned by RT-PCR from the roots of Narcissus tazetta ‘Yunxiang’. The gene was further characterized by analyzing its tempo-spacial expression patterns in N. tazetta ‘Yunxiang’ plants， as well as changes in its expression in the leaves and roots under different stresses and stress-related hormones， and by analyzing the NtNAC1 over-expressing transgenic tobacco plants. The results showed that the cloned full-length cDNA was 1083 bp long， containing an ORF of 918 bp long which would putatively encode a peptide of 306 amino acid residues. The deduced protein possessed a highly conserved DNA binding domain， NAM， at its N-terminal， and was grouped， together with its most closely related proteins， MusaSNAC1 and TaNAC47， into the SNAC1 subgroup on the phylogenetic tree. Quantitative real-time PCR results showed that the expression level of NtNAC1 in petals and coronas first increased and then decreased as the floral organs developed， and reached a peak in the early flowering period. NtNAC1 was abundantly expressed in roots and leaves， and was induced by the treatments of ABA， MeJA， SA， H2O2， NaCl and PEG， indicating that it may be involved in the morphogenesis of floral organs in addition to its principal role in the responses of plants to abiotic stresses. Nine transgenic tobacco lines carrying NtNAC1 were obtained by agrobacterium-mediated transformation and three of them were over-expressing lines. The NtNAC1 over-expressing lines showed better developed root systems and higher survival rates under the treatments of high concentrations of salt and mannitol， as compared with the non-transgenic plants. Our results showed that expressing NtNAC1 increased stress tolerance of plants and its potential in the improvement of abiotic stress resistance of N. tazetta could be further exploited.
　　Keywords  Narcissus tazetta‘Yunxiang’; NAC transcription factor; abiotic stress; functional analysis 　　DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.012
　　植物經常遭受干旱、高鹽等非生物脅迫，對其生長發育造成負面影響。通過分子育種方法來改善植物的脅迫耐受性很有意義[1]。作為植物中最大的轉錄因子家族之一的NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）轉錄因子除參與植物生長發育外，還在抵御生物和非生物脅迫中發揮重要作用[2]，并已用于基因工程來改善植物的脅迫耐受性[3]，如，水稻OsNAC14響應ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫，過表達植株穗數多、灌漿率高，表現出優于野生型的抗旱性[4];大豆GmNAC085轉入擬南芥，干旱脅迫下過表達植株蒸騰速率降低，生長遲緩，增強了對干旱的耐受性[5];陸地棉GhSNAC3受高鹽、干旱和ABA處理誘導表達，過表達該基因的轉基因煙草在逆境脅迫下初生根伸長、鮮重增加，抗旱性和耐鹽性提高[6];菊花DgNAC1在ABA、鹽、干旱、低溫處理下上調表達，過表達該基因的轉基因菊花的葉水勢、相對含水量升高，具有更高的抗旱性和耐鹽性[7];堿蓬S1NAC8通過調節脅迫響應基因的表達，增強轉基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性[8];多毛番茄ShNAC1受PEG、4 ℃和鹽脅迫上調，但過表達ShNAC1負調控轉基因植株的抗寒/旱和耐鹽能力[9];御谷PgNAC21在ABA和鹽脅迫下誘導表達，在擬南芥中過表達該基因使GSTF6、COR47、RD20等脅迫應答基因的表達量上調，促進轉基因植株種子萌發、根系伸長，提高植株對鹽脅迫的耐受性[10]。但目前對中國水仙NAC轉錄因子在逆境脅迫下的調節作用知之甚少。
　　中國水仙為冬季主要觀賞花卉之一，但其產量和品質在很大程度上受外界環境因子影響。這是因為其鱗莖肥大，且根為肉質根，生長發育期間對水分要求高。水仙需要在夏季打破休眠萌芽，全球氣溫變暖和旱季延長會導致水仙休眠期延長、萌芽期推遲、全生育期縮短、發育不良、產品質量下降等后果，這種影響在水仙主產地漳州日益顯現。因此，提高水仙對脅迫的耐受性，培育抗逆水仙新品種有著現實需求。
　　李夢思等[11]從‘云香’水仙中克隆了NtNAC3153，表達分析發現NtNAC3153在ABA、高鹽和50 ℃脅迫下能被誘導，故該基因可能和其他作物的同類基因一樣參與抗逆調控。本研究以抗性強的水仙新品種‘云香’為研究材料，克隆獲得1條NAC基因NtNAC1，分析了其在組織及逆境脅迫下的表達，現將結果報道如下。
　　1  材料與方法
　　1.1  材料
　　供試材料為多花水仙新品種‘云香’。2017年10月初選取三年生種球置于4 ℃低溫下處理1個月，之后進行外源激素和非生物脅迫處理：0.1 mmol/L脫落酸（ABA）、0.1 mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、2 mmol/L水楊酸（SA）、10 mmol/L過氧化氫（H2O2）、250 mmol/L氯化鈉（NaCl）和20%聚乙二醇（PEG6000），以未經處理（0 h）為對照，處理期間分別采集根和葉。常溫下水培種球至開花，期間分別采集根、葉、鱗莖等組織部位，以及花器官整個發育時期的花瓣和副冠。具體處理過程和取樣方式參照溫秀萍等[12]的方法。所采樣品用EZNA Plant RNA Kit（OMEGA）試劑盒提取樣品總RNA，電泳檢測選取完整的RNA經反轉錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）合成cDNA，無酶水稀釋至工作濃度10 μmol/L，?20 ℃保存，用于后續PCR試驗。
　　1.2  方法
　　1.2.1  NtNAC1基因的全長cDNA的克隆與分析  從‘云香’水仙轉錄組中查找NAC基因，選取ORF完整且差異表達的序列，經Blastp比對分析選取1條可能與抗性相關的基因進行研究。Primer 6.0設計引物NtNAC1-F：5-CAAGAATGAGGGCTGAAGTT-3和NtNAC1-R：5′-GAAGAAGAATGGGAAGAAGGAC-3′，以根尖cDNA為模板，用TaKaRa Ex Taq進行基因RT-PCR擴增，具體擴增體系和反應程序參照試劑盒參數，退火溫度為58 ℃。擴增產物經1%瓊脂糖電泳檢測，凝膠成像儀觀測割取目的條帶，EZNA Gel Extraction Kit（OMEGA）試劑盒膠回收純化，連接pMD18-T（TaKaRa）轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，過夜培養挑取單菌落，菌液PCR鑒定后送測序。
　　為預測NtNAC1蛋白的生物學功能，利用在線工具Protparam、TMHMM、SignalP、Netphos等分別分析氨基酸理化性質、跨膜結構、信號肽、磷酸化位點;利用SOPM、Swiss-model預測蛋白二、三級結構;利用Blastp進行同源蛋白基因的檢索，MEGA 6.0鄰近法構建系統進化樹。
　　1.2.2  NtNAC1基因的表達分析  設計qRT-PCR引物NtNAC1-YG-F：5′-GGTTGGATGATTGGGTTCTC-3′和NtNAC1-YG-R：5′-CGTGTCCTCGTTTGCTTCTA-3′，內參同前人研究[13]，引物為Actin-F：5′-TGCCCAGAAGTGCTATTCCAG-3′和Actin-R：5′-GTTGACCCACCACTAAGAACAATG-3′。擴增體系參照SYBR? Premix Ex Taq?（TaKaRa）試劑盒參數選用25 μL體系，反應程序：預變性95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，39個循環數。65～95 ℃每隔0.5 ℃分析溶解曲線，檢測引物的專一性。每個處理均重復3次，采用2???Ct法計算相對表達量。
　　1.2.3  NtNAC1表達載體構建  根據載體構建酶切原則，選用Spe Ⅰ和Asc Ⅰ（NEB）在37 ℃下雙酶切載體pMDC140，電泳檢測回收大片段線性化載體。同時采用In-Fusion克隆技術，設計含酶切位點的引物NtNAC1-V-F：5′-CGACTCTAGAA CT AGTCAAGAATGAGGG CTGAAGTT-3′（Spe I）和NtNAC1-V-R：5′-TAGA GTCGAGGCGCGC CG AAGAAGAATGGGAAGA AGGAC-3′（Asc I）擴增目的基因，產物回收純化，通過5X In-Fusion HD Enzyme Premix連接得到2× 35S ：： NtNAC1-G US融合載體。 　　1.2.4  煙草的遺傳轉化及分子檢測  以無菌組培苗齡5周的煙草葉片為材料，切成1～2 cm2的葉盤預培養3 d后，將2×35S ：： NtNAC1-GUS植物表達載體通過凍融法轉化到農桿菌GV1301菌株中，28 ℃下培養液體菌液OD600值為0.4～0.6，4000 r/min離心15 min收集菌體，再以含100 mmol/L AS（乙酰丁香酮）的MS液體培養基重懸菌體，室溫靜置5 h后，葉盤法[14]轉化煙草。通過含有潮霉素（Hyg）的MS培養基篩選愈傷組織、抗性芽至獲得抗性植株，以TransDirect Plant Tissue PCR Kit（TRAN）試劑盒提取DNA，用于PCR鑒定，同時GUS組織化學法染色幼嫩葉片觀察顯色結果，于顯微鏡下拍照。
　　1.2.5  NtNAC1轉基因煙草抗旱性和耐鹽性鑒定  篩選飽滿的T1代種子，消毒后置于含有Hyg的1/2 MS培養基室溫培養，同時將野生型種子置于1/2 MS平板培養至種子萌發，一部分幼苗分別轉移到含有10 μmol/L ABA、150 mmol/L NaCl、150 mmol/L甘露醇的1/2 MS平板垂直培養，以1/2 MS平板為對照，培養7 d后測量根長。另一部分幼苗移栽花盆營養土（泥炭土∶蛭石=3∶1）培養，3～4葉期時分別進行不同脅迫處理，以野生型植株做對照。室溫條件下連續干旱脅迫處理15 d，觀測植株長勢。高鹽處理之前需控制土壤水分，防止土壤水分過大稀釋鹽溶液，影響脅迫效果，控水10 d后，以400 mmol/L NaCl連續脅迫處理15 d，每3 d澆灌150 mL，觀測植株表型。
　　1.3  數據分析
　　所有實驗均進行3次技術及生物學重復。采用SPSS 20軟件統計數據，進行單因素方差分析不同脅迫隨處理時間變化的差異顯著性（P<0.05），并使用Sigmaplot 12軟件作圖。
　　2  結果與分析
　　2.1  NtNAC1基因cDNA全長的克隆與分析
　　采用RT-PCR克隆方法，擴增得到1條長度為1083 bp的目的條帶，命名為NtNAC1（GenBank：MG755187.1）。NtNAC1基因的ORF為918 bp，編碼306個氨基酸，組成蛋白分子式C1579H2395N439O484S12，分子量為35.7 ku，等電點為5.83，其中帶負電的氨基酸（Asp+Glu）43個，帶正電的氨基酸（Arg+Lys）39個，不穩定系數為54.53，脂肪系數為52.91，親水性總平均系數為?0.995，推測其屬于酸性、親水性、不穩定型蛋白。NtNAC1蛋白沒有檢測到跨膜區域和信號肽，且亞細胞定位預測位于細胞核，推測該蛋白為非分泌型蛋白和核蛋白。絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化修飾位點分別有19、9、4個，該蛋白以絲氨酸修飾為主導，可能參與信號轉導、生長發育等生理過程。蛋白二級結構元件主要由58.50%無規則卷曲、24.18%α-螺旋、14.05%延伸鏈、3.27%-轉角結構組成;蛋白三級結構同源建模參考與抗性相關的水稻SNAC1蛋白，結構相似性達84.62%，推測NtNAC1具有相似功能，參與抗逆性調控。
　　2.2  NtNAC1蛋白同源比對及進化樹分析
　　利用NCBI搜索NtNAC1蛋白同源序列進行多序列比對，分析發現與單葉植物石刁柏（Asparagus officinalis）、番紅花（Crocus sativus）和雙子葉植物睡蓮（Nelumbo nucifera）、博落回（Macleaya cordata）相似性分別為79%、69%、65%、63%，而與同一品種‘云香’NtNAC3153蛋白序列一致性僅為31.05%。NtNAC1蛋白氨基端同源性高，第15～141位氨基酸殘基組成NAM結構域，包含A～E等5個子域，其中子域A、C、D相較B、E同源性高，C子域含有核定位信號（NLS：PRDRKYP），而羧基端同源性低，由此認為NtNAC1是NAC轉錄因子家族新成員。選取已知具有抗逆脅迫功能的水稻、擬南芥、小麥等不同植物的NAC氨基酸序列構建系統進化樹聚類分析，NtNAC1主要聚集SNAC1亞組，與香蕉MusaSNAC1和小麥TaNAC47親緣關系較近。
　　2.3  NtNAC1基因組織表達分析
　　‘云香’水仙NtNAC1基因在各個器官、組織以及不同的花發育時期中均有表達，在根中優勢表達，為鱗莖的31.32倍。花瓣和副冠中NtNAC1表達量在花蕾期沒有發生顯著變化，
　　之后該基因的表達量隨花器官發育呈先上升后下降趨勢，始花期副冠中NtNAC1的表達量達到峰值，為花苞期的2.68倍，盛花期花瓣中NtNAC1的表達量到達峰值，為花苞期的4.52倍。同一發育時期，除花蕾期花瓣中NtNAC1的表達量稍微低于副冠，其余時期高于副冠，
　　2.4  NtNAC1在非生物脅迫下表達分析
　　通過qRT-PCR技術分析NtNAC1基因在外源激素ABA、MeJA、SA和H2O2、NaCl、PEG非生物脅迫處理下的表達模式。結果顯示，同一處理時間點根中NtNAC1上調表達量大于葉片，具有組織表達特異性;同一組織中NtNAC1的表達量隨處理時間的延長不同程度上調，且差異顯著。外源激素ABA和MeJA誘導下，葉和根中NtNAC1的表達水平上調8～16倍，SA誘導上調表達量相對較低在4倍以下。H2O2脅迫下，NtNAC1的表達量在葉片先下降后上升，24 h時達到峰值，為對照的5.72倍;根中的表達量與葉片相反，先上升后下降至對照水平，而后急劇上升12 h時達到峰值，為對照的7.57倍。NaCl和PEG脅迫下，葉和根中NtNAC1的表達量上調20倍以上，均呈現先上升后下降的趨勢，葉片NaCl脅迫12 h時出現峰值為對照的23.79倍，而PEG脅迫峰值出現較晚，24 h時出現峰值為對照的28.80倍;根中NaCl和PEG表達量均在6 h時達到峰值，分別為對照的42.88倍、34.61倍。結果表明‘云香’水仙NtNAC1基因能被ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG等非生物逆境脅迫誘導表達。 　　2.5  NtNAC1轉基因煙草的分子鑒定
　　隨機選擇12株抗性植株，稀釋其DNA至同一濃度，PCR擴增1～9號泳道出現約1000 bp特異性條帶，與重組質粒長度一致，獲得9株陽性株系。GUS染色顯示，陽性株系呈現藍色且維管束部分顏色較深。以上結果均表明‘云香’NtNAC1已成功導入煙草中，選取條帶明亮的2、3、9號株系繼續培養，用于后續轉基因植株的功能鑒定。
　　2.6  NtNAC1轉基因煙草株系抗逆性鑒定
　　T1代陽性株系根長實驗發現，正常生長條件下（對照組1/2 MS），野生型與轉基因植株根長無明顯差別。模擬逆境脅迫下根長均受到不同程度的抑制，野生型植株根系伸長嚴重受阻，其中ABA處理后，植株根長小于10 mm受抑制程度最嚴重，甘露醇、NaCl脅迫下，轉基因株系根長較野生型發育良好，這表明NtNAC1過表達增強了轉基因煙草根系對ABA的敏感性和對干旱、高鹽的耐受性。
　　煙草植株WT和3個轉基因株系（TP-2、TP-3、TP-9）3～4葉期時進行抗逆性鑒定，對照組正常生長條件，過表達NtNAC1轉基因植株和野生型表型無顯著差異;實驗組15 d脅迫處理后發現，干旱脅迫下轉基因煙草相較對照組生長發育遲緩，葉片表面積小，野生型植株葉片開始變黃，而轉基因植株長勢良好;鹽脅迫下大部分植株葉片萎蔫發黃，甚至枯萎，野生型枯萎速度高于轉基因植株，表明水仙NtNAC1過表達減輕了逆境脅迫產生的損害，提高了煙草的抗性。
　　不同小寫字母表示在相同組織中不同處理時間點的差異顯著性（P<0.05）。
　　3  討論
　　NAC轉錄因子廣泛存在于植物中，參與響應高鹽、干旱、低溫或高溫等非生物脅迫，其基因功能的多效性在轉基因應用中非常有益，即通過改變1個NAC基因的表達實現多種定向改良[15]，因此克隆和鑒定優良非生物脅迫相關NAC轉錄因子具有重要意義。‘云香’水仙較其他多花水仙品種抗性強[16]，本研究利用RT-PCR技術從‘云香’水仙中克隆了1個新的NAC轉錄因子基因NtNAC1，其編碼的蛋白與同一品種‘云香’NtNAC3153蛋白相似性低，在C端幾乎沒有相同的殘基，表明兩者分化較久，在功能上可能有所分化。這一現象也出現在其他植物中，包括擬南芥AtNAM[17]、大豆GmNAC1～6[18]、陸地棉GhNAC1～6[19]、鷹嘴豆CarNAC1～6[20]等。進化樹分析結果，NtNAC1聚分在SNAC1亞家族。同一亞家族中，小麥TaNAC47在擬南芥中過表達時增加了植株對外源ABA的敏感度，增強了對干旱、鹽和低溫脅迫的耐受性[21];香蕉MusaSNAC1通過提高干旱脅迫下保衛細胞中H2O2含量來誘導氣孔關閉，減少水分損失，從而提高過表達株系的抗旱性[22]。由此，可推測NtNAC1與這些蛋白具有相似功能，即響應逆境脅迫，提高植株的抗性。
　　本研究中，NtNAC1的表達水平主要受ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG脅迫誘導，具有時空特異性。這一表達模式不僅與‘云香’NtNAC3153相似，即均能被ABA、高鹽誘導（NtNAC1峰值表達量高于NtNAC3153，其基因功能可能更強大），還與SNAC1亞家族其他植物基因類似，例如，擬南芥ANAC019、ANAC072在葉和根中高表達，鹽脅迫下葉和根中的表達量上調[23];小麥TaNAC29、TaNAC2D在葉中高表達，根中表達量相對較低，鹽、干旱、ABA等非生物脅迫下葉和根中的表達量均急劇上升[24];小麥TaNAC47受ABA、4 ℃、PEG、高鹽脅迫誘導表達[21]。顯然，抗逆基因的可誘導性有利于植物快速響應不同的逆境，增加在逆境下的生存能力。本文發現，NtNAC1的表達具有時空特異性，比如在根中表達量高、葉中次之;在花瓣和副冠中的表達模式也不同，除可能與這些組織或器官的發育階段不同對逆境的抵抗力不同這一解釋外，我們不能排除該基因還有其他潛在的生物學功能。
　　大量研究表明，通過轉基因技術將NAC過表達，能不同程度地提高對非生物脅迫的耐受性。如，小麥TaRNAC1在根系過量表達，可以促進根發育、增加生物量和產量，提高抗旱性[25];陸地棉GhNAC79過表達提高了轉基因擬南芥、棉花的抗旱性[26];鷹嘴豆CarNAC6在擬南芥中過表達，促進轉基因植株根系生長，提高其對干旱和高鹽的耐受性[27]。本研究同樣發現，采用農桿菌介導法將水仙NtNAC1轉入煙草中過表達，促進了轉基因植株的根系發育，增加了干旱和鹽脅迫下的存活率，表型觀察未發現NtNAC1過表達有明顯的負面影響，表明該基因作為抗旱、耐鹽的良好遺傳資源，在水仙的抗性分子改良上有潛在應用價值。
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