高活性纖溶酶菌株篩選與基因克隆表達

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　　摘 要：本研究以本實驗室曾在酒曲、酒糟、窖泥等樣品中分離的具有醬香味的13株菌株作為出發菌株，經脫脂奶粉平板、纖維蛋白雙層平板篩選出纖溶酶活性最高的菌株GZHZV-8，結合形態學特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析，GZHZV-8菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。以GZHZV-8菌株總DNA為模板擴增出纖溶酶基因的編碼區，與pMD18-T載體連接、轉化至大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α，分析表明纖溶酶基因開放閱讀框包含1092 bp堿基，編碼363個氨基酸。纖溶酶基因與表達載體pET-22b（+）連接轉化至E.coli BL21中表達，表達菌株經IPTG誘導表達分泌活性纖溶酶，培養后測得發酵上清液、菌體細胞破碎上清液和菌體細胞破碎沉淀的纖溶酶活力分別為613.26 IU/mL、407.38 IU/mL、993.12 IU/mL。
　　關鍵詞：纖溶酶; 基因克隆; 序列分析; 表達
　　中圖分類號：Q939.9
　　 文獻標識碼：A
　　文章編號：1008-0457（2019）02-0001-07     國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.02.001
　　Abstract： In this study， 13 Maotai-flavor producing strains isolated from samples such as daqu， fermented grains and pit mud were used as the starting strains. GZHZV-8， the strain with the highest fibrinolytic activity， was screened by the skim milk powder plate and fibrin double layer plate. Combined with morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence homology analysis， the strain GZHZV-8 was identified as Bacillus amyloliquefaciens. The coding region of the fibrinolytic enzyme gene was amplified by using the total DNA of GZHZV-8 as a template， and ligated with pMD18-T vector and transformed into Esc-herichia coli DH5α. The results indicated that the open reading frame of fibrinolytic enzyme gene contained 1092 bp and encoded 363 amino acids. The fibrinolytic enzyme gene was ligated with expression vector pET-22b（+） and transformed into E. coli BL21， and the expression strain was induced to express the active fibrinolytic enzyme by IPTG. The fibrinolytic activity of fermentation supernatant， cell disruption supernatant and cell debris was 613.26 IU/mL， 407.38 IU/mL and 993.12 IU/mL， respectively.
　　Key words：fibrinolytic enzyme; gene cloning; sequence analysis; expression
　　醬香型白酒中微生物種類豐富[1]，許多微生物不僅具有產醬香風味物質的功能，還具有體外溶栓、抗凝血的生理作用[2-3]。日本學者須見洋行從日本傳統發酵食品納豆中提取出一種具有纖溶活性的納豆激酶[4]。傅莉等[5]在1997年報道了一株產纖溶酶的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），且在最適宜條件下，酶活力為200 U/mL。Nakamura T等[6]首次對納豆激酶的基因進行了研究，發現該基因是一種絲氨酸蛋白酶，可直接降解纖維蛋白。AI Hai-xin等[7]構建納豆激酶原核表達載體在E.coli BL21中克隆高效表達，產量顯著提高，但酶活性相對降低。劉北域等[8]將納豆激酶基因克隆在大腸桿菌-枯草桿菌穿梭表達載體pBNK中，在枯草桿菌中表達，酶比活力達12000 U/mg。Lu Xiao等[9]將來自解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶基因的啟動子和信號肽編碼序列克隆并與編碼枯草桿菌蛋白酶DFE的前肽和成熟肽的序列融合。將該雜合基因插入大腸桿菌/枯草芽孢桿菌穿梭質粒載體pSUGV4中。重組枯草桿菌蛋白酶DFE基因在枯草芽孢桿菌WB600中成功表達，其纖維蛋白溶解活性為200 IU/mL。王開敏等人[10]篩選出了高纖溶活性菌株，用PCR技術擴增出纖溶酶基因的編碼區，將編碼區序列連載到穿梭載體pYES2上，再導入到釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）H158細胞中，經誘導發酵后纖溶酶活力為222.49 IU/mL。本研究以本實驗室保存的分離自酒曲、酒糟、窖泥等樣品中產醬香細菌中篩選產高纖溶酶活性的菌株為材料結合形態學特征、生理生化特征以及分子生物學方法鑒定此菌株，并利用基因工程技術對纖溶酶基因進行克隆與表達。 　　1 材料與方法
　　1.1 菌株
　　GZJSⅠ-2、GZJSⅠ-5、GZJSⅠ-12、GZJSⅡ-1、GZHZⅡ-8、GZHZⅤ-9、GZHZⅤ-8、GZHZⅥ-11、GZJSⅠ-12-2、GZJSⅠ-12-4、GZJSⅠ-12-5、GZJSⅠ-12-7、GZJSⅠ-12-12菌株為貴州大學微生物實驗室保存。大腸桿菌E.coli DH5α、大腸桿菌E.coli BL21購自于昆明碩擎生物。
　　1.2 試劑
　　限制性內切酶（BamH I、Hind III）、T4連接酶、PrimeSTAR購自TaKaRa;纖維蛋白原購自索萊寶;凝血酶（840 IU/支）、尿激酶（1240 IU/支）購自中國食品藥品檢定研究院;pMD18-T購自TaKaRa;pET-22b（+）購自淼靈質粒平臺。
　　1.3 主要培養基
　　牛肉膏蛋白胨培養基[11]，種子培養基、發酵培養基及產纖溶酶初篩培養基[3]。
　　1.4 方法
　　1.4.1 產纖溶酶菌株的初篩[3]
　　將實驗菌株活化，并轉接到脫脂奶粉初篩培養基上，37℃恒溫倒置培養48 h后對菌落直徑（d）和透明圈直徑（D）各進行3次測定，計算D/d（D/d：菌株產蛋白能力的大?。瑢a蛋白能力相對較強的菌株定為復篩的出發菌株。
　　1.4.2 產纖溶酶菌株的復篩[3]
　　初篩出的菌株接種于種子培養基，30℃、150 r/min震蕩培養24 h后按照4%的量轉接于發酵培養基中，30℃、150 r/min震蕩培養96 h。將發酵液在4℃，8000 r/min離心20 min，取10 μL上清液點樣于纖維蛋白雙層平板上，室溫置10 min后倒置于37℃恒溫培養箱培養18 h，測定溶解圈垂直直徑大小，各測3次計算平均值，垂直直徑的乘積為溶解圈的面積。溶解圈面積最大的菌株作為高活性纖溶酶菌株。
　　1.4.3 纖溶酶活性測定
　　根據Astup報道[12]的纖維蛋白雙層平板法測定纖溶酶活力，并以尿激酶（標準品）做纖溶酶活力標準曲線。
　　1.4.4 GZHZV-8菌種鑒定
　　菌株形態特征及生理生化特征鑒定根據《伯杰手冊》（R.E.布坎南和N.E.吉本斯等，1984）第八版和《常見細菌鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）[13-14]進行。
　　參照天根基因組DNA提取試劑盒提取DNA，利用16S rDNA基因擴增引物[15]（27F：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3;1492R：5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3）進行擴增，PCR擴增體系：DNA模板2 μL，引物各2 μL，2×Es Taq MasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環30次;72℃終延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖電泳分析后由英濰捷基雙向測序。16S rDNA基因測序結果與細菌模式菌株網（http：//www.ezbiocloud.net/ezgenome）中的序列進行比對，下載相似度較高（>90%）的相關模式菌株16S rDNA，采用鄰接法（Neighbor-Joining）利用MEGA 5.0構建系統發育樹[15]。
　　1.4.5 擴增纖溶酶基因
　　擴增根據NCBI報道的纖溶酶基因DNA序列（Gene Bank AY720895.2）的編碼區應用Primer Premier 5.0設計并合成一對引物（F：5-CGGGATCCGTGAGAGGCAAAAAGGTA TGG-3BamH I;R：5-CCCAAGCTTTTACTGAGC TGCCGCCTGTACG-3Hind III）。
　　以篩選菌株總DNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增體系：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，Template 1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，無菌水32.5 μL。PCR反應程序為：98℃預變性3 min，98℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸90 s，35個循環，72℃延伸5 min。PCR產物用1%凝膠電泳檢測。
　　1.4.6 纖溶酶基因克隆及重組子的篩選鑒定
　　根據DNA膠回收試劑盒對PCR產物進行切膠回收純化，用限制性內切酶BamH I與Hind III對pMD18-T克隆載體與PCR純化產物進行雙酶切再切膠回收純化、連接、轉化至克隆宿主E.coli DH5α感受態細胞中，將一定量的轉化液涂布于相應的抗性LB平板上，通過PCR擴增、質粒雙酶切及測序驗證陽性克隆子。
　　1.4.7 纖溶酶基因的序列分析[16]
　　利用NCBI、ExPASy在線工具對纖溶酶基因的序列進行預測分析。
　　1.4.8 表達載體的構建
　　用BamH I與Hind III雙酶切克隆質粒與表達載體PET-22b（+），T4 DNA Ligase連接，轉化至大腸桿菌E.coli BL21，取一定量的轉化液涂布于相應的抗性LB平板上，通過PCR擴增、質粒雙酶切、測序驗證陽性重組菌。
　　1.4.9 重組菌纖溶酶活性測定
　　用一定量的IPTG誘導發酵重組菌，在4℃、8000 r/min離心20 min，分別收集上清液和菌體，菌體經超聲波破碎（破碎5 s，間隔5 s），于4℃、10000 r/min離心20 min，分別收集破碎上清液與沉淀。測定pET-22b（+）空載體、經IPTG誘導重組菌的發酵上清液、菌體破碎上清液及沉淀的纖溶酶活性。 　　2 結果與分析
　　2.1 產纖溶酶菌株的初篩
　　13株菌均具有不同程度的產蛋白能力，經過脫脂奶粉平板測得13株菌的產蛋白能力（表1）。
　　2.2 產纖溶酶菌株的復篩
　　根據初篩時測定的菌株產蛋白能力大小，挑選6株產蛋白能力較強的菌株進行復篩，由表2可知GZHZV-8纖溶酶活力最高，為2344.23 IU/mL。纖維蛋白平板法測定的溶解圈見圖1。
　　2.3 尿激酶標準曲線
　　按照尿激酶標準曲線制作方法，繪制尿激酶活性標準曲線，標準曲線方程為：y=1.1938x-0.2265，R2為0.9976，具有良好的線性關系（圖2）。
　　2.4 菌種鑒定
　　2.4.1 形態學鑒定
　　菌株GZHZV-8經鏡檢與菌落形態特征的觀察，鏡檢為G+桿狀細菌，兩端橢圓，形成芽孢，芽孢中生或稍偏端生、柱狀（圖3），芽孢染色芽孢呈綠色，芽孢囊紅色（圖4）。單個菌落在牛肉膏蛋白胨培養基上培養24 h，菌落成圓形、乳白色、表面光滑濕潤、有光澤、不易挑取。
　　2.4.2 生理生化鑒定
　　2.4.3 分子生物學鑒定
　　PCR產物經凝膠電泳檢測，在1300bp處出現特異性條帶。PCR擴增獲得的16S rDNA基因序列與相關模式菌株構建系統發育樹，株菌GZHZV-8的16S rDNA基因序列與其相似度較高的模式菌株聚成1個小分支（圖5），GZHZV-8與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）DSM 7（T）（FN597644）相似度為99.92%。結合形態學特征和生理生化特征以及分子生物學鑒定，該菌株可鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
　　2.5 纖溶酶基因的擴增
　　PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現在約1200 bp左右有一條亮帶（圖6），與纖溶酶基因克隆設計引物的PCR產物大小一致，測序結果表明，克隆序列長度為1205 bp。
　　2.6 重組子鑒定
　　擴增纖溶酶基因與克隆載體連接后，經菌落PCR、質粒PCR、質粒雙酶切驗證，用1.0%凝膠電泳檢測該片段大小為1200 bp左右，與預期片段大小相符。經測序驗證纖溶酶基因已經準確的連接到克隆載體上（圖7、8）。
　　2.7 纖溶酶基因序列與編碼蛋白的理化性質的預測分析
　　利用NCBI的ORF Finder 在線分析，發現纖溶酶基因的編碼區全長包含1092 bp開放閱讀框，共編碼363個氨基酸。將克隆的基因序列輸入GenBank進行比對，結果表明，克隆的纖溶酶基因序列與已報道的纖溶酶基因序列核酸水平上相似度為97%，氨基酸水平上相似度為98%。突變了11個堿基，以致有3個氨基酸發生了改變。
　　利用ExPASy軟件中ProtParam工具對纖溶酶基因編碼蛋白的理化性質進行分析，蛋白理論分子式為C1621H2570N448O525S8，蛋白分子量為36.9914 kDa，理論等電點（PI）為8.73，含量最多的是丙氨酸（A）為13.8%，其次是絲氨酸（S）為12.7%，最低的是精氨酸（R）為0.6%。帶負電荷的殘基總數（Asp+Gly）：25，帶正電荷的殘基總數（Arg+Lys）：28。不穩定系數值26.29，是一種穩定蛋白。此蛋白的脂肪系數為78.51，親水性的平均值為-0.105，表明該蛋白可能是親水性蛋白。
　　2.8 重組表達質粒的構建與酶切
　　重組表達質粒經菌落PCR、質粒PCR、質粒雙酶切經驗證，1%凝膠電泳檢測（圖9、10），在1200 bp和5500 bp左右出現亮帶，分別與pET-22b（+）和纖溶酶基因的大小相符，說明纖溶酶基因已正確插入表達載體。
　　2.9 重組纖溶酶的活力測定
　　經檢測，重組表達質粒得到有活性的分泌性表達，根據尿激酶標準曲線計算出誘導發酵上清液酶活力為613.26 IU/mL，菌體破碎上清液的酶活力為407.38 IU/mL，菌體破碎沉淀酶活力為993.12 IU/mL（圖11）。
　　3 結論與討論
　　用大腸桿菌表達外源基因有許多優點，如大腸桿菌繁殖迅速，易于大規模發酵生產，表達外源基因的經驗較為豐富[17]。有許多的研究者使用大腸桿菌表達系統來表達纖溶酶基因，如閏達中[18]將納豆激酶基因克隆到載體pTYB102后，在大腸桿菌TR2566中表達出有活性的納豆激酶，表達量達到30%以上。劉雪[19]將纖溶酶原基因連接到pET-27b（+）載體上，轉化到大腸桿菌中，經葡萄糖誘導，能實現分泌活性的表達，發酵上清液纖溶酶活力為212.6 U/mL，活性蛋白分子量為28 kDa，但纖溶酶在大腸桿菌中的表達式為包涵體，分子量為38 kDa。因此，大腸桿菌表達系統對于纖溶酶的大規模生產具有重要意義。本研究以本實驗室從酒曲、酒糟、窖泥等樣品中分離的具有醬香味的13株菌株作為實驗出發菌株，經脫脂奶粉平板、纖維蛋白雙層平板篩選出纖溶酶活性最高的菌株GZHZV-8，結合形態學特征、生理生化特性實驗及16S rDNA序列同源性分析，GZHZV-8菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaci-ens）。用PCR技術擴增的GZHZV-8菌株纖溶酶基因與報道的纖溶酶基因在核酸與氨基酸水平上有高度的同源性，將纖溶酶基因與表達載體pET-22b（+）連接，構建重組表達載體，使纖溶酶基因成功轉入大腸桿菌E.coli BL21，經IPTG誘導從而實現纖溶酶基因的表達。本研究結果表明，本實驗室篩選的高活性菌株纖溶酶基因能在大腸桿菌中分泌表達。但重組菌纖溶酶活性與原始菌株相比，有所下降。pET-22b是利用T7啟動子的高效原核表達載體。在根據Grossman[20]報道，葡萄糖能維持pET系統在λDE3宿主菌中低水平表達的蛋白，阻止T7溶菌酶的過量表達，且可以有效避免或延緩質粒丟失情況。在劉雪[19]的研究中驗證了這一報道。羅文華等[21-22]分別利用枯草芽孢桿菌自生的啟動子和枯草桿菌168的重疊啟動子P43構建兩種重組表達載體，分別在枯草芽孢桿菌WB800中表達，實驗表明帶P43啟動子的重組菌纖溶酶活力是帶枯草芽孢桿菌自身啟動子的1.87倍。趙宇易等[23]報道了纖溶酶基因在大腸桿菌中的表達多以包涵體的形式存在。本研究中纖溶酶活力的降低，可能與啟動子、表達宿主菌有一定的關系，劉雪與羅文華的報道[19，21-22]為本研究后續纖溶酶活性提高的研究提供了理論依據。 　　參考文獻：
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