一株溶磷解鉀菌的分離篩選與鑒定

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　　摘要 為獲得具有高效溶磷解鉀能力的菌株，采用選擇性培養基從柑橘根部土壤中分離篩選具有溶磷解鉀作用的菌株，通過液體培養法進一步比較篩選菌株的溶磷解鉀能力，選擇溶磷解鉀能力強的菌株進行形態特征、生理生化特征、16S rDNA及gyrB基因同源性分析。結果表明，LW-1、LW-2、LW-3和LW-4這4株菌株具有解磷解鉀作用;其中，LW-3的解磷解鉀能力最強，其溶解無機磷量為19.06 μg/mL，相對增加38.64%，溶解有機磷量為17.06 μg/mL，相對增加28.57%，溶解鉀量為33.59 μg/mL，相對增加15.96%;經鑒定確定菌株LW-3為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌LW-3，是理想的菌肥生產用菌株。
　　關鍵詞 紡錘形賴氨酸芽孢桿菌;解磷;解鉀;篩選;鑒定
　　中圖分類號 S182文獻標識碼 A
　　文章編號 0517-6611（2019）10-0005-05
　　Abstract In order to obtain a strain of bacteria with efficient activity on solubilizing phosphate and potassium，strains were isolated by using selective medium in the root soil of citrus.The solubilization activity of strains were further compared by liquid culture method，then the strain with the strongest ability to dissolve phosphorus and potassium will be identified by the characteristics of morphological，physiological and biochemical tests and the homology analysis of 16S rDNA and gyrB genes.The results showed that there were four strains of LW1，LW2，LW3 and LW4 having the activity on solubilizing phosphorus and potassium on which the LW3 had the best performance.The strain of LW3 had inorganic phosphatesolubilizing content of 19.06 μg/mL，organic phosphatesolubilizing content of 17.06 μg/mL and potassiumsolubilizing content of 33.59 μg/mL，which relatively increased by 38.64%，28.57% and 15.96% respectively.The strain of LW3 was identified as Lysinibacllus fusiformis LW3 after a series of tests，which had most potentiality as fertilizerproducing bacteria.
　　Key words Lysinibacllus fusiformis;Phosphorus removal;Potassium removal;Screening;Identification
　　磷和鉀是植物生長發育必需的營養元素，土壤磷、鉀的供應直接影響作物的產量和品質。我國土壤中磷、鉀的形態主要是不易被作物吸收利用的難溶性磷及礦物態鉀，能供植物直接吸收利用的磷、鉀資源極其有限[1]。為實現作物的增產增收，農業生產中長期大量施用磷肥、鉀肥，造成土壤板結、環境污染、農藥殘留等一系列的生態環境問題和農產品質量安全問題[2]。由于水溶態磷進入土壤后易發生化學固定或吸附固定，使得磷肥當季利用率極低，僅為10%～25%[3]，大大降低了磷肥肥效。因此，尋找一種既能增加土壤磷、鉀有效性，提高土壤肥力及磷鉀肥利用效率又能減少環境污染的方法成為當前研究的熱點。研究表明，將解磷菌、解鉀菌制成相應的菌劑施入到土壤中，可以將土壤中難溶性磷和礦物鉀釋解為速效態磷、鉀，提高磷、鉀的有效化利用，減少化肥的施用量，促進植物生長，提高作物產量和改善品質[4-7]，同時微生物菌劑具有無毒、無污染的特點，既有化肥的效果，又能避免化肥的缺點，具有廣泛的開發應用前景。為獲得具有高效解磷解鉀能力的菌株，筆者從柑橘根際土壤中分離篩選溶磷解鉀菌，研究其溶磷解鉀能力并進行菌種鑒定，以期為生物菌肥的研制提供理論依據和菌種資源。
　　1 材料與方法
　　1.1 試驗材料
　　1.1.1 儀器與試劑。
　　主要儀器是隔水培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司），搖床培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司），恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司），高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），原子吸收分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）等;主要試劑是過氧化氫溶液、氫氧化鈉溶液、硝酸溶液、鉬銻貯存溶液、鉬銻抗顯色劑、二硝基酚指示劑、磷標準溶液、鉀標準溶液等。
　　1.1.2 培養基。
　　活化培養基：營養瓊脂（NA）或LB培養基。種子培養基：玉米淀粉3.00 g，蔗糖1.20 g，硫酸銨0.48 g，硫酸鎂1.20 g，磷酸氫二鉀1.20 g，氯化鐵0.12 g，碳酸鈣1.20 g，酵母粉0.60 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。解磷固體培養基：①解無機磷固體培養基為葡萄糖10.00 g，硫酸銨0.50 g，氯化鈉0.30 g，硫酸鎂0.30 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，碳酸鈣5.00 g，氯化鉀0.30 g，磷酸三鈣5.00 g，瓊脂粉15.00 g，加蒸餾水定容至1 000 mL ，pH 7.0～7.5;②解有機磷固體培養基同無機磷固體培養基，但將磷酸三鈣5.00 g替換為卵磷脂0.30 g。解鉀固體培養基：蔗糖10.00 g，磷酸氫二鈉1.00 g，硫酸銨0.50 g，硫酸鎂1.00 g，酵母膏0.20 g，硫酸亞鐵0.03 g，碳酸鈣2.50 g，鉀長石粉10.00 g，瓊脂粉15.00 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。解磷液體培養基：①解無機磷液體培養基為葡萄糖10.00 g，磷酸三鈣5.00 g，硫酸銨0.50 g，氯化鈉0.20 g，氯化鉀0.20 g，七水硫酸鎂0.30 g，硫酸錳0.03 g，七水硫酸亞鐵0.03 g，酵母粉0.50 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5;②解有機磷液體培養基同無機磷液體培養基，但將磷酸三鈣5.00 g替換為卵磷脂0.30 g，并加碳酸鈣5.00 g。解鉀液體培養基為蔗糖10.00 g，七水硫酸鎂0.50 g，硫酸銨0.20 g，氯化鈉0.10 g，碳酸鈣0.10 g，鉀長石粉5.00 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。培養基于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。 　　1.2 試驗方法
　　1.2.1 溶磷解鉀菌株的分離篩選。
　　從廣東江門古井采集柑橘根部土壤，將土壤自然風干并研磨成粉得土壤樣品。稱取5.0 g土壤樣品溶于裝有45 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，150 r/min，30 ℃振蕩20 min，得到10-1的土壤懸液，將土壤懸液置于80 ℃水浴鍋中水浴30 min，然后用移液槍吸取1 mL至裝有9 mL無菌水試管中，充分振蕩成10-2稀釋液，按無菌操作依次稀釋成10-5稀釋液。吸取100 μL稀釋液分別涂布于解無機磷、解有機磷和解鉀固體培養基上，于35 ℃培養箱培養，觀察產生溶磷圈、溶鉀圈的菌株，并挑取于NA培養基上進一步純化，將各菌株重復平板溶磷解鉀試驗。最后將各純培養菌株轉入25%甘油管并保存于4 ℃冰箱中。
　　1.2.2 液體培養試驗。
　　將保存的菌株于營養瓊脂（NA）或LB培養基上活化培養24 h，挑取一環活化的各菌株分別接入50 mL種子培養基中，150 r/min、30 ℃搖床培養至穩定期，測定各培養液的OD600，并用無菌水將各培養液OD600稀釋至相同后作為種子液;按5%接種量將種子液分別接種至100 mL 已滅菌的解無機/有機磷/鉀液體培養基中，以不接種任何菌液的解無機/有機磷/鉀液體培養基為對照（CK），3個重復，于30 ℃、150 r/min條件下培養7 d，制得解無機磷、解有機磷和解鉀的搖瓶發酵液供解磷解鉀能力測定。
　　1.2.3 解磷能力測定。
　　將解無機磷和解有機磷的搖瓶發酵液分別轉入蒸發皿中，在水浴鍋中濃縮至10 mL左右，加入2.0 mL 20% H2O2溶液，繼續蒸發并不斷攪動，直至黏性物質完全消化。將溶液轉移至離心管中3 500 r/min離心10 min，將上清液收集至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，以磷酸二氫鉀為標準物質，按鉬銻抗比色法[8]測定溶液中的磷含量，根據速效磷相對增加量衡量菌株的解無機磷和解有機磷能力。
　　1.2.4 解鉀能力測定。
　　將解鉀的搖瓶發酵液轉入蒸發皿中，在水浴鍋中濃縮至10 mL左右，加入2.0 mL 20% H2O2溶液，繼續蒸發并不斷攪動，如此反復至黏性物質完全消化。將溶液轉移至離心管中3 500 r/min離心10 min，將上清液收集至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，以KCl為標準物質，用原子吸收分光光度計測定溶液中速效鉀含量。根據速效鉀相對增加量衡量菌株的解鉀能力。
　　1.2.5 菌株的鑒定。
　　選擇解磷解鉀能力最強的菌株進行鑒定。菌株培養性狀的觀察：按《細菌分類學》的細菌培養性狀方法對菌株進行培養性狀的觀察。常規生理生化特征的測定：對菌株進行氧化酶試驗、VP試驗、明膠水解試驗、產H2S試驗、檸檬酸生長等試驗。分子生物學特性測定：將純化的菌株LW-3送至中國科學院微生物研究所進行16S rDNA及gyrB基因測序，獲得測序結果后登陸美國國家生物技術信息所（national center for biotechnology information，NCBI）頁面，使用Blast程序進行同源性比對分析，并通過MEGA 5.0軟件采用鄰接法建立菌株系統發育樹。綜合菌種的細胞形態、生理生化特征、16S rDNA序列及gyrB序列分析，確定菌株的屬種。
　　2 結果與分析
　　2.1 溶磷解鉀菌株的分離篩選結果
　　用解無機磷、解有機磷和解鉀固體培養基共分離出4株溶磷解鉀菌。對4株菌株編號為LW-1～LW-4，并重復平板溶磷解鉀試驗，測定溶磷透明圈（D）、解鉀透明圈（D）及菌落直徑（d），以D/d的大小初步判斷菌株的解磷解鉀能力[9]，結果見表1。由表1可知，LW-3和LW-4在解無機磷、有機磷和鉀培養基上均產生透明圈，LW-1和LW-2分別在解無機磷和解鉀平板上無明顯透明圈產生。LW-3在解無機磷、有機磷和解鉀平板上的D/d均比其他3株菌株的D/d大，初步斷定LW-3的解磷和解鉀能力最強。
　　2.2 解磷解鉀能力 由表2可知，在解無機磷方面， LW-2、LW-3與LW-4菌株發酵液的速效磷含量相比CK顯著增加，LW-1菌株發酵液的速效磷含量與CK無顯著差異，其中，LW-3菌株發酵液速效磷含量高達49.33 μg/mL，解無機磷量為19.06 μg/mL，相對增加量最大，說明4株菌株中，LW-3的解無機磷能力最強，與平板解無機磷試驗結果一致。在解有機磷方面，各菌株均具有明顯的解有機磷效果，其中， LW-1與LW-2解有機磷能力無顯著差異，LW-3菌株發酵液速效磷含量及相對增加量最大，分別為59.71 μg/mL和28.57%，解有機磷量為17.06 μg/mL，其解有機磷能力也最強，與平板解有機磷試驗結果一致。在解鉀方面，4株菌株的發酵液速效鉀含量存在顯著差異且高于CK的速效鉀含量，但LW-2在解鉀平板上無明顯透明圈產生，原因可能是平板中鉀濃度太大，使得LW-2的解鉀效果無法顯現;4個菌株發酵液中，速效鉀含量最高的是LW-3菌株發酵液，達210.41 μg/mL，解鉀能力最強。綜合可知，4株菌株中，LW-3在解磷和解鉀方面均表現最顯著效果，解磷解鉀能力最強，是生物菌肥研制理想的菌種資源。
　　2.3 菌株LW-3的鑒定結果
　　2.3.1 菌株LW-3培養形狀。
　　2.3.2 菌株LW-3生理生化特征。
　　2.3.3 菌株LW-3分子生物學特性。
　　2.3.3.1 16S rDNA序列分析。
　　2.3.3.2 gyrB基因序列分析。
　　結合gyrB基因序列分析對菌株LW-3進一步確認，其gyrB基因系統發育樹見圖5。由圖5可知，菌株LW-3與紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis RB-21，檢索號：CP010820.1）的同源性達99%，因此，綜合菌株的菌落及細胞形態、生理生化特征、16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等分析，確定菌株LW-3為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌LW-3。 　　3 結論與討論
　　從土壤中共分離得到4株溶磷解鉀菌，液體培養試驗結果顯示，4株菌株中，菌株LW-3的解磷和解鉀能力最強，溶解無機磷量為19.06 μg/mL，相對增加38.64%，溶解有機磷量為17.06 μg/mL，相對增加28.57%，溶解鉀量為33.59 μg/mL，相對增加15.96%，是理想的菌肥生產用菌株，經鑒定確定該菌株為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌LW-3（Lysinibacllus fusiformis LW-3）。
　　除具有溶磷解鉀作用外，研究表明，紡錘形賴氨酸芽孢桿菌可產大量胞外多糖、氨基甲酸乙酯水解酶、植酸酶等有益物質，具有溶藻、降解原油、除鉛、防治水稻紋枯病等特性[11-18]，對研究開發生物菌肥、生物農藥、動物飼料添加劑、水體凈化劑、土壤修復劑等具有重要意義，開發應用前景極其廣闊。
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