一株野生側耳菌種鑒定及生物學特性

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　　摘  要：以1株野生側耳屬菌株為試驗材料，采用ITS測序、同源序列比對、構建系統發育樹進行鑒別，通過單因素試驗確定影響其菌絲生長的因素。結果表明：該野生側耳屬菌株為哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus），其菌絲生長的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為牛肉膏，最適碳氮比為10∶1，最適pH值為6.0，最適培養溫度為25～30℃。
　　關鍵詞：哥倫比亞側耳;ITS測序;生物學特性
　　中圖分類號 S646.14   文獻標識碼 A   文章編號 1007-7731（2019）09-0034-4
　　Abstract：A wild Pleurotus strain was used as a test material. The wild strain was identified by ITS sequencing， homologous sequence alignment and phylogenetic tree construction. The biological characteristics were determined by single factor test.The results showed that the wild Pleurotus strain was identified as Pleurotus columbinus， the best carbon source was sucrose，the best nitrogen source was beef extract，the optimum carbon to nitrogen ratio was 10：1，the optimum pH value was 6.0， and the optimum culture temperature range was 25-30℃.
　　Key words：Pleurotus columbinus;ITS sequencing;Biological characteristics
　　側耳屬真菌營養價值較高，具有重要的經濟價值和藥用價值，是我國栽培面積較大的食用菌種類[1-2]。側耳屬的傳統分類及鑒定主要是基于子實體的宏觀形態和微觀結構特征的由于其子實體形態受到地域分布、子實體發生時間以及環境條件等因素的影響而出現不穩定性，且一些近緣物種的子實體形態非常相似，僅僅依靠外形很難分辨，因而傳統的分類方法已無法滿足一些未知種屬真菌的分類及鑒定要求[3-4]。隨著分子生物學的發展，許多學者利用分子生物學技術進行菌物系統發育和菌種輔助鑒定，其中以ITS序列分析技術應用最為廣泛。rDNA的ITS序列具有高度保守性，表現為種內相對一致，同時也有可以變化的區域，其有較為豐富的變異位點，這為種屬間的區分提供了可能[5]。本研究以采自秦巴山區的1株野生側耳菌株進行ITS測序及同源序列比對，通過構建系統發育樹鑒定該菌株為哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus）;同時，對其生物學特性開展了研究，旨在明確該菌株的最適碳源、氮源、碳氮比、pH值、溫度等生理指標，為其后續馴化栽培提供理論依據。
　　1 材料與方法
　　1.1 試驗材料 供試野生側耳菌株于2017年采自陜西省鎮巴縣小洋村，經組織分離獲得原種備用。
　　1.2 試驗方法
　　1.2.1 野生側耳菌株的分子鑒定 采用DNA提取試劑盒提取DNA，利用通用引物ITS1、ITS4進行PCR擴增，將擴增后的PCR產物送上海生工進行ITS序列測序，測得序列登錄NCBI網站用Blast工具進行同源序列比對，從GenBank下載搜索到排名前6位同源序列的ITS序列，應用MEGA-X軟件進行系統發育分析，采用kimura2-parameter模式計算遺傳距離，采用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，Bootstrap參數設定為1000。
　　1.2.2 影響菌絲生長因素的確定
　　1.2.2.1 碳源 參照張國廣等[3]方法進行，以葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生素B110mg，瓊脂20g）中20g葡萄糖的含碳量為標準，分別用與20g葡萄糖相等含碳量的玉米粉、麥芽糖、果糖、淀粉、蔗糖代替葡萄糖進行碳源因子比較試驗，觀察不同碳源處理對菌絲生長的影響。
　　1.2.2.2 氮源 以葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生素B110mg，瓊脂20g）中5g蛋白胨的含氮量為標準，分別用與5g蛋白胨相等含氮量的硝酸銨、硫酸銨、谷氨酸、酵母浸粉、牛肉膏、硝酸鉀、尿素代替蛋白胨進行氮源因子比較試驗，觀察不同氮源處理對菌絲生長的影響。
　　1.2.2.3 碳氮比 在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基中，改變蛋白胨添加量配成碳氮比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的培養基，觀察不同碳氮比處理對菌絲生長的影響。
　　1.2.2.4 溫度 在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基中，分別設置15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等5個培養溫度，觀察不同溫度處理對菌絲生長的影響。
　　1.2.2.5 pH值 在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基中，調節pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，觀察不同pH值處理對菌絲生長的影響。
　　1.3 項目測定 以上每個處理3次重復，接種后每日觀察菌絲生長情況，直至其中1個處理中菌絲長滿培養皿后停止觀察，測量菌絲生長長度，計算菌絲生長速率[3]。菌絲生長速率（mm/d）=菌絲生長長度/培養天數
　　1.4 數據分析 數據用平均值±方差的方式表述。對各處理菌絲平均生長速率進行方差分析，用新復極差法進行多重比較和顯著性分析（P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著）[3]。 　　2 結果與分析
　　2.1 菌種鑒定結果 以野生側耳菌株的DNA為模板，利用通用引物ITS1、ITS4進行PCR擴增，得到1條長度為651bp的序列（圖1）?；趓DNA ITS堿基序列構建的NJ系統發育樹（圖2）表明，該野生側耳菌株的ITS序列與 GenBank MG282476.1 Pleurotus columbinus （哥倫比亞側耳）序列遺傳距離最近，其次為GenBank MG282464.1  Pleurotus columbinus（哥倫比亞側耳）。與GenBank KY962504.1 Pleurotus cornucopiae （cornucopia mushroom）（黃白側耳）遺傳距離稍遠。與3株糙皮側耳GenBank KY962480.1 Pleurotus ostreatus （oyster mushroom）、GenBank KY962440.1 Pleurotus ostreatus、GenBank KY96244
　　2.1  Pleurotus ostreatus （oyster mushroom） 遺傳距離最遠，初步鑒定該野生側耳為哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus）。
　　2.2 影響菌絲生長的因素
　　2.2.1 碳源 由表1可知，該野生側耳菌株具有較廣的碳源譜，6種供試碳源均能吸收利用，但在不同碳源培養基上，菌落形態、菌絲長勢及生長速率有較大差異。其中，以蔗糖為碳源時效果最佳，菌落圓形、完整、致密，菌絲生長速率最快，為（10.32±0.07）mm/d;其次為淀粉、玉米粉、麥芽糖、葡萄糖，三者之間無顯著差異;葡萄糖培養基中菌絲長勢較弱，生長速率較慢，為（9.43±0.73）mm/d;果糖培養基中菌絲生長速率最慢。因此，在試驗范圍內確定蔗糖為最佳碳源。
　　2.2.2 氮源 由表2可知，該野生側耳菌絲在不同氮源培養基中的長勢及生長速率存在一定的差異。在牛肉膏培養基中菌落致密，長勢最好，生長速率最快，為（10.37±0.18）mm/d;其次為酵母浸粉和蛋白胨，生長速率分別為（10.23±0.28）mm/d、（9.79±0.91）mm/d;在以上3種復合氮源培養基中菌落致密，三者間差異不顯著，與其他氮源處理培養基差異極顯著。菌絲在谷氨酸培養基中長勢較好，菌落較致密，生長速率較快，為（9.18±0.20）mm/d，與其他差異顯著。在硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀培養基中長勢相對較差，其中硝酸鉀培養基中生長速率最慢，三者間差異顯著。在尿素培養基中未觀察到菌絲生長。因此，培養該野生側耳菌株氮源優選復合氮源，其中以牛肉膏效果最佳，其次為酵母浸粉和蛋白胨。
　　2.2.3 碳氮比 由表3可知，不同碳氮比對野生側耳菌絲生長影響較顯著，在試驗范圍內，菌絲培養階段碳氮比為10∶1時菌絲長勢最好，生長速率最快，為（9.61±0.42）mm/d。
　　2.2.4 pH 由表4可知，該野生側耳菌絲適宜的pH值范圍較廣，在pH5.5～8.0范圍內培養基中菌絲均可正常生長，pH6.0時野生側耳菌絲生長速率最快，但與pH5.5和pH6.5時差異不顯著，pH7.0～8.0時生長較差。因此，該野生側耳菌絲更適宜在偏酸性培養基中生長，試驗范圍內其生長最適pH值為6.0。
　　2.2.5 溫度 由表5可知，不同溫度對該野生側耳菌絲生長影響顯著，其中25℃、30℃時菌絲生長最旺盛，低于25℃或高于30℃菌絲生長受到抑制。因此，在試驗范圍內該野生側耳菌絲生長最適溫度范圍為25～30℃。
　　3 結論與討論
　　哥倫比亞側耳在分類學上歸屬一直不甚明確，鄭和斌等通過rDNA ITS序列測序，認為哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus）與灰白側耳（Pleurotus spodoleucus）為同物異名[6];Singer根據形態、解剖特征、生理特性將側耳分為6組，認為哥倫比亞側耳是糙皮側耳的變種[7];王呈玉通過對標本宏觀和微觀結構的觀察，將哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus）作為糙皮側耳的1個生態型進行討論[1]。本研究中通過觀察NJ系統發育樹，該野生側耳的ITS序列與GenBank中編號為 MG282476.1的哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus）序列遺傳距離最近，鑒定該野生側耳為哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus），在NCBI中查詢可知，該哥倫比亞側耳屬擔子菌門（Basidiomycota），傘菌亞門（Agaricomycotina），傘菌亞綱（Agaricomycetidae）， 傘菌目（Agaricales）， 側耳科（Pleurotaceae），側耳屬（Pleurotus）真菌。
　　通過平板培養法對該野生側耳進行單因素試驗，研究影響其菌絲生長的因素。不同碳源對菌絲生長有明顯的影響，菌絲在蔗糖培養基中長勢最佳、生長速率最快，其次為淀粉、玉米粉、麥芽糖培養基，再次為葡萄糖培養基，果糖培養基中最差，試驗結果中蔗糖培養與常見葡萄糖培養對菌絲生長影響差異極顯著。因此，優化培養基碳源應選擇蔗糖。不同氮源處理對菌絲生長有明顯的影響，菌絲在復合氮源（牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨）中長勢最好、生長速率最快，可能是因為復合氮源中營養物質豐富，所含核苷酸類、礦物質類水溶性物質能夠滿足菌絲生長的營養需求。在無機氮源（硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨）中長勢較弱，可能是因為無機氮源成分單一，不能有效提供菌絲合成蛋白質、核酸等含氮大分子的必需元素。菌絲在尿素培養基中無明顯生長，可能是因為尿素培養基高溫滅菌過程中產生了某種物質抑制菌絲生長。不同碳氮比處理對菌絲生長也有影響，碳氮比為10∶1時能滿足菌絲生長對碳氮的要求，菌絲長勢最好。在不同pH值環境下，菌絲在偏酸性培養基中長勢良好。在不同溫度情況下，菌絲在25～30℃培養基中長勢良好。試驗結果表明，該哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus）菌絲生長最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為牛肉膏，最適碳氮比為10∶1，最適pH為6.0，最適培養溫度范圍為25～30℃。
　　參考文獻
　　[1]王呈玉.中國側耳屬[Pleurotus（Fr.）Kumm.]真菌系統分類學研究[D].吉林：吉林農業大學，2004：1-96.
　　[2]高山.基于nLSUrDNA和ITS序列對側耳屬系統發育關系的研究[D].武漢：華中農業大學，2004：1-70.
　　[3]張國廣，盧文朋，林溜章，等.一株野生有柄樹舌的鑒定、菌絲培養特性及馴化栽培[J].北方園藝，2015（22）：153-157.
　　[4]王鋒尖，周向宇，甘露.一株野生食用菌的形態及分子鑒定[J].北方園藝，2017（21）：159-162.
　　[5]宋冰，付永平，郭昱秀，等.一株野生側耳屬菌株的鑒定及生物學特性[J].北方園藝，2017（24）：182-188.
　　[6]鄭和斌.核rDNA ITS序列在側耳屬分子分類學上的應用[D].武漢：華中農業大學，2005：1-43.
　　[7]Singer R.The Agaricales in Modern Taxonomy，4th edn.Koenigstein[J].Germany：Koeltz Scientific Books，1968，174-179.
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　　基金項目：陜西省重點研發計劃重點產業創新鏈項目（2017ZDCXL-NY-01-04）;陜西省重點研發計劃一般項目（2017NY-021）。
　　作者簡介：孫瑞澤（1990—），女，陜西渭南人，碩士，助理農藝師，從事食用菌、中藥材等經濟作物育種及栽培研究工作。  *通訊作者
　　收稿日期：2019-03-24
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