東北野生薄荷揮發油成分及抑菌活性研究

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　　摘要 [目的]研究東北野生薄荷的揮發油化學成分及抑菌活性。[方法]運用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，采用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）對揮發油化學成分進行分析。運用濾紙片瓊脂板擴散法和二倍稀釋法，對揮發油的抑菌活性和最小抑菌濃度進行研究。[結果]薄荷揮發油出油率為0.8%，通過運用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）鑒定出東北野生薄荷的揮發油成分有59種。提取出的薄荷揮發油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等常用菌種均有抑制作用，且抑菌圈直徑分別為10.92、10.25、9.18 mm，最小抑菌濃度分別為1.56、3.13、12.50 μL/mL。[結論]用GC-MS法檢測出東北野生薄荷的揮發油化學成分較多，且揮發油表現出良好的抑菌活性，具有很大的市場潛力。
　　關鍵詞 薄荷;揮發油;氣相色譜-質譜聯用技術;抑菌活性;抑菌圈;最小抑菌濃度
　　中圖分類號 R284.1文獻標識碼 A
　　文章編號 0517-6611（2019）10-0170-03
　　Abstract [Objective] The research aimed to study the chemical composition and antibacterial activity of the volatile oils from wild Mentha haplocalyx in Northeast China. [Method]GCMS was employed to analyze the composition of the volatile oil from Mentha haplocalyx extracted.The antibacterial activity and minimum inhibitory concentration of volatile oil were studied by using the paper agar diffusion method and double broth dilution method. [Result]The yield of volatile oil from Mentha haplocalyx was 0.8%. 59 main vo1atile compounds were identified by the gas chromatographymass spectrometry. The extracted volatile oil had an inhibitory effect on common strains such as Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Bacillus subtilis，and the diameter of the inhibition zone was 10.9，10.25 and 9.18 mm， respectively. The minimum inhibitory concentrations were 1.56， 3.13， 12.50 L/mL， respectively. [Result]Many chemical constituents of the volatile oil from wild Mentha haplocalyx in Northeast China were detected by GCMS. The volatile oil showed good antibacterial activity，so Mentha haplocalyx Briq may have great market potential.
　　Key words Mentha haplocalyx Briq.;Volatile oil;Gas chromatographymass spectrometry;Antibacterial activity;Inhibition zone;Minimum inhibitory concentration
　　薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）為唇形科植物，是一種有特種經濟價值的芳香作物，是中華常用中藥之一。我國的薄荷屬植物主要分布于華東和東北等地區[1]。薄荷揮發油化學成分主要有薄荷醇、L-薄荷酮、胡薄荷酮、芳樟醇、香芹酚、α-松油醇和香芹酮等，且具有抑菌[2]、抗炎鎮痛[3]、抗氧化[4]、抗病毒、祛痰、保肝利膽、抗早孕、促滲透等作用。目前，薄荷揮發油及其衍生品已廣泛應用于醫藥、食品和化妝品等領域。國內外一些學者對薄荷屬植物揮發油的化學成分以及對各種病原菌的抑菌活性進行了大量研究。靳有才等[5]對青海野生薄荷揮發油的成分進行了分析，共鑒定出42種化學成分。Rahman等[6]運用GC-MS檢測出薄荷精油有29種化合物，同時表明精油對肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、假單胞菌屬等的抗菌活性具有較大的潛力。Singh等[7]通過瓊脂擴散法評價了一些革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌株，發現薄荷油具有強烈的抗菌和抗氧化活性，但需要進行額外的研究以確認最低抑菌濃度（MIC）。所以為了進一步探索國產野生薄荷揮發油的化學成分及其抑菌活性，筆者對黑龍江牡丹江地區野生薄荷的揮發油進行研究。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 儀器。
　　HP7890A-5975 型氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫科技有限公司）;RE52A 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）;SHB-循環式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）;FA 2004電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司）;FLC-3 生物潔凈工作臺（哈爾濱市東聯公司）;立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）;HPS-160生化培養箱（哈爾濱市東聯電子公司）。 　　1.1.2 試劑。
　　正己烷、丙酮（分析純，天津金匯太亞化學試劑有限公司）;正構烷烴對照品（C10～C20，上海西域機電股份有限公司）。
　　1.1.3 試材。
　　薄荷采自黑龍江省牡丹江地區，由佳木斯大學方洪壯教授鑒定，經室內干燥、粉碎后按中國藥典揮發油測定甲法，提取揮發油，其油為淡黃色液體，得油率為0.8%。所得揮發油用無水硫酸鈉脫水，供分析用。所用菌種為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，由東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室趙修華教授惠贈。
　　1.2 方法
　　1.2.1 揮發油提取。
　　取供試品藥材50 g，粉碎后制成粗粉，用水蒸氣蒸餾法提取揮發油。將揮發油溶液轉移至旋轉蒸發儀的蒸發瓶中，用正己烷洗滌無水硫酸鈉，并入蒸發瓶中，在50 ℃下減壓濃縮除去溶劑，得到具有濃郁香氣的淡黃色透明液體，密封避光冷藏。
　　1.2.2 GC-MS分析條件。
　　1.2.2.1
　　色譜條件。HP-5MS 石英毛細管色譜柱，規格為 30 mm×0.25 mm×0.25 μm，進樣口溫度 280 ℃，接口溫度 280 ℃;載氣為高純度氦氣（99.99%），分流比為 100∶1，進樣體積 1 μL。程序升溫條件：初始溫度60 ℃，以3 ℃/min升溫至144 ℃，等溫5 min;再3 ℃/min升溫至254 ℃，280 ℃后運行10 min 。
　　1.2.2.2
　　質譜條件。標準EI源（70 eV），離子源溫度為230 ℃，接口溫度為280 ℃，四極桿質量分析器，掃描范圍30～450 amu，掃描速度為3.42 scans/s。
　　1.2.3 體外抑菌試驗。
　　1.2.3.1 樣品制備。
　　將薄荷揮發油用丙酮混溶制成含量濃度為 100 μL/mL的混合溶液，用0.22 μm濾膜過濾除菌，備用。將培養至對數生長的3種菌種，以無菌生理鹽水稀釋制成含菌量約為1×106 CFU/mL的菌懸液，備用。
　　1.2.3.2 揮發油抑菌活性的研究。
　　采用濾紙片瓊脂板擴散法測定揮發油的抑菌圈。吸取3種供試菌懸液100 μL分別涂布于瓊脂培養基平板上。將直徑為 6 mm 的無菌濾紙片浸于薄荷揮發油中 0.5 h。在無菌操作下，將濾紙片呈三角狀貼于涂布了相應菌液的固體培養基平板，在恒溫 37 ℃條件下培養 24 h。準確記錄抑菌圈的直徑，并設置丙酮陰性對照組和青霉素陽性對照組，每組平行 3次。
　　1.2.3.3 揮發油最低抑菌濃度（MIC）的測定。
　　采用二倍稀釋法，將配制好的薄荷揮發油溶液進行濃度梯度稀釋，加入到已經處理好的培養基中，混合均勻，并使濃度為25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 μL/mL;待培養基冷卻凝固后，平板劃線
　　接種，在恒溫 37 ℃條件下培養 24 h。觀察結果，以丙酮作為
　　對照，肉眼可見菌落生長者為無抑制作用，各組均平行3 次，以完全沒有菌落生長的最低精油濃度為其最低抑菌濃度。
　　2 結果與分析
　　2.1 揮發油含量及化學成分分析
　　經水蒸氣蒸餾法提取得到揮發油0.6 mL，出油率為0.8%。按照上述測試條件進行 GC-MS分析，得到薄荷揮發油的GC-MS 總離子流圖（圖1）。采用自動質譜解卷積定性系統（AMDIS）結合色譜保留指數（RI）定性化學成分，并用峰面積歸一化法測定化學成分的相對含量。在設定的儀器條件與分析方法下，共鑒別出59種物質，占總含量的96.54%，其定性及定量結果見表1。薄荷揮發油主要成分有芳樟醇、月桂烯，含量分別為63.30%、3.68%，占總鑒定出物質的66.98%。另外，在鑒定出的物質中，有11種相對含量大于1%，它們分別是3-辛酮（含量為1.04%）、（Z）-β-羅勒烯（含量為2.10%）、順-芳樟醇氧化物（含量為3.05%）、反-芳樟醇氧化物（含量為2.88%）、脫氫芳樟醇（含量為1.01%）、α-松油醇（含量為2.63%）、苯異戊酸（含量為1.12%）、香葉醇（含量為1.75%）、茴香腦（含量為2.37%）、丁香酚（含量為2.07%）、石竹烯（含量為2.44%）。
　　2.2 揮發油抑菌活性測定
　　薄荷揮發油對不同菌株均有一定的抑制作用，對不同菌株的抑菌圈大小見表2。由表2可知，薄荷揮發油對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用最強，抑菌圈直徑為10.92 mm，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌也有明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑分別為10.25、9.18 mm。
　　2.3 揮發油最小抑菌濃度測定
　　不同濃度的薄荷揮發油對不同的菌株均有不同程度的抑制作用，抑菌結果見表3。其中對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為1.56、3.13、12.50 μL/mL，表明薄荷揮發油的抑菌作用與濃度相關，濃度太低抑菌效果就會變差。
　　3 結論與討論
　　經水蒸汽蒸餾法提取薄荷揮發油，利用GC-MS聯用技術從薄荷揮發油中鑒定的化學成分數為59個，主要成分有芳樟醇、月桂烯，含量分別為63.30%、3.68%，與新疆薄荷[8]、湖南永州薄荷[9]主要成分以及含量有所區別，可能是地域不同薄荷揮發油的主要成分也有區別。利用濾紙片瓊脂板擴散法和二倍稀釋法，測得東北野生薄荷對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等常見菌種具有良好的抑菌活性，此結果與Reddy等[10] 發現精油對金黃色葡萄球菌、黃色微球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌等具有較高的抗菌活性結果相似，但濃度太低將不能達到最好的效果。這為東北野生薄荷資源的開發提供了依據，有助于東北薄荷在藥用食用等方面的進一步推廣應用。 　　參考文獻
　　[1] 中國科學院《中國植物志》編輯委會.中國植物志：第66卷 第2冊 [M].北京：科學出版社，1977.
　　[2] 朱梅芳，唐宇，鄭琴，等.不同提取方式對連翹、荊芥、薄荷揮發油成分及抗菌活性的影響[J].中草藥，2018，49（12）：2845-2854.
　　[3] 李崗，余德順，楊軍，等.超臨界CO2萃取薄荷揮發油及其抗氧化能力的研究[J].食品科技，2013，38（1）：276-279.
　　[4] 楊倩.薄荷揮發油的化學型分析及抑菌、抗炎活性研究[D].鎮江：江蘇大學，2017.
　　[5] 靳有才，慶易薇，郭珍.青海野生薄荷揮發油成分GC-MS分析[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（23）：143-146.
　　[6] RAHMAN A，SHANTA Z S，RASHID M A，et al.In vitro antibacterial properties of essential oil and organic extracts of Premna integrifolia Linn[J].Arabian journal of chemistry，2016，9（S1）：475-479.
　　[7] SINGH R，SHUSHNI M A M，BELKHEIR A.Antibacterial and antioxidant activities of Mentha piperita L.[J].Arabian journal of chemistry，2015，8（3）：322-328.
　　[8] 孫亞棟，阿布力米提·阿布都卡德爾.薄荷葉揮發油成分的GC-MS分析[J].新疆大學學報（自然科學版），2017，34（1）：61-63.
　　[9] 田祎穎，姚婷，黃光文，等.湖南永州薄荷揮發油化學成分GC-MS分析[J].山東化工，2018，47（15）：96-97.
　　[10] REDDY D N，ALRAJAB A J，SHARMA M，et al.Chemical constituents，in vitro antibacterial and antifungal activity of Mentha × Piperita L （peppermint）essential oils[J/OL].Journal of King Saud UniversityScience，2017[2018-11-20].doi：http：//dx.doi.org/10.1016/j.jksus.2017.07.013.
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