具有除草活性的生防菌株GD-9發酵條件優化及菌劑制備

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　　摘要 為了明確具有除草活性的生防菌株GD9發酵過程中各因子的配比和最優條件，采用單因素試驗對菌株最適碳源、氮源、載體、固態發酵基質進行了篩選，應用正交試驗設計研究了碳源、氮源、初始含水量、接種量、初始pH、培養時間、培養溫度7種因素對菌株活菌數的影響。試驗結果表明菌株GD9最佳固態發酵條件為：氮源NaNO3 58.4 mg/g，碳源葡萄糖48.4 mg/g，培養基質最適初始含水量為258 mg/g，最適接種量為0.26 mL/g，初始 pH 7.6，最佳培養時間147.8 h，最佳培養溫度30.7℃，最適宜的載體為黏土，分散劑為聚乙烯醇，穩定劑為膨潤土，潤濕劑為糊精。通過發酵試驗結果制備生防菌株GD9的固體菌劑，該研究為菌劑的商品化生產奠定基礎。
　　關鍵詞 生防菌株; 除草活性; 發酵條件; 菌劑制備
　　中圖分類號： S 451.1， S 476
　　文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018255
　　Abstract In order to clarify the proportion and optimal conditions of various factors in the fermentation process of biocontrol strain GD9 with herbicidal activity， the single factor experiment was performed to screen the optimal carbon source， nitrogen source， carrier and solid fermentation substrate of the strain. The orthogonal experiment design was used to study the influences of carbon source， nitrogen source， initial water content， inoculation amount， initial pH value， culture time and culture temperature on the colony number of the strain. The experimental results showed that the optimal solid state fermentation conditions of strain GD9 were Nsource NaNO3 58.4 mg/g， Csource glucose 48.4 mg/g， 258 mg/g of initial water content of the culture medium， 0.26 mL/g of inoculation amount， the initial pH 7.6， 147.8 h and 30.7℃ of culture time and temperature， respectively. The optimal carrier， dispersant， stabilizer and wetting agent were clay， polyvinyl alcohol， bentonite and dextrin. The solid microbial inoculum of biocontrol strain GD9 was prepared through fermentation test results. This study laid a foundation for the commercial production of the microbial inoculum.
　　Key words biocontrol strain; herbicidal activity; fermentation conditions; preparation of microbial inoculum
　　農田雜草是農業生態系統的一個組成部分，直接或間接地影響著農產品的質量、產量和品質[1]。目前在生產上，農田雜草的防治一般采用人工防除和化學防除等方法。人工除草效率相對低、成本高，而長期采用化學防除易使雜草易產生抗藥性，導致用藥量增加、防效降低、環境污染等弊端[23]。與化學除草劑相比，微生物除草劑具有許多潛在的優勢：（1）這類除草劑作用位點新穎，是現有化學除草劑未涉及的，有利于雜草的抗性治理;（2）這些天然產物可以為新的除草劑合成方案提供線索;（3）在低濃度時這些產物便可發揮較高生物活性;（4）微生物天然產物在環境中的半衰期比合成農藥短得多，易迅速降解或解毒，因此登記試驗比化學農藥所用的時間短、資金少;（5）植物細胞培養技術、發酵技術、分子遺傳學和基因工程最新發展把生產昂貴的天然產物防除雜草變成了現實[46]。微生物繁殖快，能廣泛利用農副產品、工農業廢水和廢棄物等進行生產，微生物除草劑被認為是綠色、無公害農藥，其防治對象不易產生抗藥性，且藥劑對農田生態環境影響小，有利于保護環境和農業可持續發展，已成為農田用藥中的首選藥劑[7]。
　　微生物除草劑的研究起步很晚，一些關鍵技術還沒有解決，許多研究還處在試驗階段，真正商品化的很少，即使有，也只是作為化學除草劑的補充。但隨著對微生物除草劑這一新的研究領域的認識不斷加深，相信它一定會成為未來除草劑市場的主流[8]。近20多年來，國外已成功地開發了一些微生物除草劑，并取得了一定的經濟效益。雙丙氨膦（bialaphos）是第一個被開發成商品除草劑的放線菌Streptomyces viridochromogenes的代謝產物。雙丙氨膦是一種可殺單子葉和雙子葉植物的非選擇性除草劑，常用于非耕地和果園防除一年生或多年生雜草，已在日本銷售[9]。目前微生物除草劑已經越來越受到重視，其研究不僅僅局限在潛力菌株的篩選，更多的菌劑已被開發出來，各種助劑的使用使微生物除草劑正向專業化和規范化發展[10]。 　　鏈霉菌Streptomyces sp. GD9菌株是分離自大刺兒菜根系土壤中的一株放線菌，前期大量試驗表明該菌株對一年生禾本科雜草野燕麥具有較好的致病作用，對野燕麥種子的萌發抑制率達90.1%，具有開發生防除草劑的潛力。本研究為了明確菌株GD9發酵相關碳源、氮源、載體、固態發酵基質、初始含水量、接種量、初始pH、培養時間、培養溫度等因素對菌株活菌數的影響，為該菌株除草菌劑的研發和商品化生產提供理論依據。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　供試菌株：GD9是分離自大刺兒菜根系土壤中的一株放線菌，保存于青海省農林科學院植物保護研究所有害生物綜合防治實驗室。
　　高氏一號培養基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂16～18 g、蒸餾水1 L、pH 7.4～7.6。
　　高氏一號液體培養基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蒸餾水1 L、pH 7.4～7.6。
　　碳源：可溶性淀粉、麥麩、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麥粉。
　　氮源：大豆粉、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素。
　　固態發酵基質：羊糞、菜籽餅、小麥秸稈、麥麩、玉米粉。
　　載體及助劑：可溶性淀粉、CaCO3、糊精、羧甲基纖維素、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉、拉開粉、十二烷基硫酸鈉、木質素磺酸鈉、白炭黑、膨潤土、輕質碳酸鈣、聚乙烯醇、腐殖酸、硅藻土、吐溫、沙子、黏土、爐渣。
　　1.2 菌株活化
　　制備高氏一號培養基，倒平板使其冷卻、凝固待用;從冰箱中取出4℃條件下保存的菌株，使其恢復到室溫狀態， 用接種針挑取適量菌絲在高氏培養基上劃線，之后放入28℃培養箱黑暗培養7 d，挑取其中部分菌絲接種到新的培養基中培養，重復此步驟2～3次，從而得到生長良好的菌落（圖1）。
　　1.3 最適碳、氮源的篩選
　　用高氏1號為基礎培養基進行碳源篩選試驗，將可溶性淀粉、麥麩、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、小麥粉作為碳源，按質量分數2%的量加入高氏1號培養基中，攪拌均勻，121℃高壓滅菌30 min，在超凈工作臺中倒入滅菌的培養皿中待其冷卻凝固，將活化后生長旺盛的菌落打8 mm菌餅， 菌絲面朝下接種于培養基中央，放入28℃恒溫培養箱黑暗培養，定期測量菌落直徑和孢子懸浮液的OD值。以不添加碳源的培養基為對照組，選出菌落生長好的碳源。每組設置3個重復。
　　用高氏1號為基礎培養基進行氮源篩選試驗，將大豆粉、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素作為氮源，按2%的量加入高氏1號培養基中，用不添加氮源的培養基作為對照組，以同樣的方法選出菌落生長好的氮源。每組設置3個重復。
　　孢子懸浮液OD值測定：用載玻片將菌落上的孢子輕輕刮下，加入5 mL超純水，用單層干凈無菌紗布過濾除去菌絲，得到孢子懸浮液。用分光光度計在600 nm波長下測其OD值，選出產孢量最佳的碳源[12]。以同樣的方法，選出產孢量最高的氮源。
　　1.4 固態發酵基質篩選
　　選用菜籽餅、玉米粉、羊糞、麥麩和小麥秸稈等價格低廉的農副產品下腳料作為固態發酵基質。每瓶中小麥秸稈10 g、羊糞15 g、菜籽餅25 g、玉米粉 25 g、麥麩25 g分別放入150 mL的三角瓶中，按質量分數2%的量加入所篩選出來的最適碳氮源、適量的自來水，充分攪拌均勻，經121℃、30 min高溫高壓滅菌后，冷卻到室溫。在超凈工作臺里每瓶接種菌液5 mL后在28℃恒溫培養箱進行培養，觀察記錄菌落生長狀況，以不接菌液的固態基質為空白對照;用分光光度計測定經過濾的菌懸液OD值，篩選出產孢量高的固態發酵基質。每組設置3個重復。
　　1.5 正交試驗優化培養條件
　　采用L25（57）正交表，測定碳源、氮源、初始含水量、接種量、初始pH、培養時間、培養溫度7個因素對菌株GD9活菌數的影響，每種因素各取5個水平（表1），對菌株GD9固態發酵條件相關上述7個因素進行正交設計得到49個處理（表2）。根據最適碳氮源和固態發酵基質的篩選結果，選用麥麩∶羊糞=1∶1作為固態發酵基質，葡萄糖作為碳源，硝酸鈉作為氮源，根據配方配制不同處理的固態發酵培養基，經121℃滅菌30 min，冷卻到室溫后，依次接入GD9發酵液，攪拌均勻，置于生化培養箱中28℃靜置培養。不同處理自然風干、粉碎，平板菌落計數法測定不同處理的活菌數。每個處理設3次重復。
　　1.6 載體篩選及劑型制備
　　用高氏1號為基礎培養基進行載體單因素試驗，將初篩出來的載體硅藻土、膨潤土、拉開粉、白炭黑及助劑羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、木質素磺酸鈉等按質量分數2%的量加入高氏1號培養基中，攪拌均勻，121℃高壓滅菌30 min，在超凈工作臺中將含不同載體或助劑的培養基倒入滅菌的培養皿中，待其冷卻凝固，將活化后生長旺盛的菌落打8 mm菌餅， 菌絲面朝下接種于培養基中央，放入28℃恒溫培養箱黑暗培養，定期測量菌落直徑和孢子懸浮液OD值。以不添加載體的基質為對照組，選出菌落生長好的載體。每組設置2個重復。根據前幾步所篩選的最適碳氮源、固態發酵基質及正交試驗優化的最佳培養條件進行菌劑的研制。在最適固態發酵基質中加適量的水、2%的碳氮源，121℃、30 min高溫高壓滅菌后，冷卻到室溫。每個白盆0.7 kg基質，接種菌液160 mL，用手攪拌均勻后用保鮮膜封口室溫培養。
　　1.7 數據分析
　　全部數據分析在DPS 6.50 數理統計分析軟件上進行。 　　2 結果與分析
　　2.1 最適碳氮源篩選
　　分別于培養第5、7 和9天測定菌株GD9在不同碳氮源培養基上的菌落直徑和孢子懸浮液OD值，結果見表3、表4。GD9在葡萄糖培養基上菌落生長最快，菌落直徑最大，葡萄糖培養基與其他碳源處理孢子懸浮液OD值之間存在極顯著性差異，在可溶性淀粉和麥麩培養基上菌落直徑略小，在小麥粉培養基上最小。在硝酸鈉培養基上菌落直徑最大，且與其他氮源處理孢子懸浮液OD值之間存在極顯著性差異;尿素培養基完全抑制菌落生長。結合菌落形態、菌落直徑和孢子懸浮液OD值，最終篩選最適碳源為葡萄糖，最適氮源為硝酸鈉。
　　2.2 固態發酵基質篩選
　　利用孢子懸浮液分光光度值判斷不同固態基質的產孢量大小。從表5可以看出，菌株GD9生長較好的固態基質為：羊糞>麥麩>菜籽餅>小麥秸稈>玉米粉;孢子懸浮液OD值方差分析結果表明，羊糞培養基上GD9產孢量與其他基質間存在極顯著差異，菜籽餅、玉米粉、麥麩和小麥秸稈之間不存在顯著性差異。因此，GD9菌株的最適產孢固態發酵基質為羊糞。
　　2.3 正交試驗優化培養條件
　　菌株GD9固態發酵的正交試驗統計結果（表6）表明，試驗的7種因素中極差R值從大到小依次為：氮源（4.72）、碳源（3.69）、初始含水量（3.51）、培養溫度（3.48）、接種量（2.85）、初始pH（2.59）、培養時間（2.56）。因此，影響菌株GD9固態發酵條件的因素作用由大到小依次為：氮源>碳源>初始含水量>培養溫度>接種量>初始pH>培養時間。從各水平的統計A值比較來看，菌株GD9的最佳固態發酵條件為：氮源硝酸鈉58.4 mg/g、碳源葡萄糖48.4 mg/g、初始含水量258 mg/g、接種量0.26 mL/g、初始 pH 7.6、培養時間147.8 h、培養溫度30.7℃。
　　2.4 載體及助劑篩選
　　表7可以看出：黏土培養基上菌落生長最快，菌落直徑最大，且黏土培養基上得到的孢子懸浮液OD值最高，與其他載體培養基的孢子懸浮液OD值之間存在極顯著差異，膨潤土、聚乙烯醇及糊精處理的次之;拉開粉和海藻酸鈉載體處理的孢子懸浮液間不存在顯著差異，完全抑制菌絲生長，菌落直徑為8.0 mm，孢子懸浮液OD值為0。其余載體處理孢子懸浮液OD值之間均存在極顯著差異。
　　綜合菌落形態、菌落直徑和孢子懸浮液OD值得出，菌株GD9最適載體和助劑為黏土、膨潤土、聚乙烯醇、糊精。
　　2.5 劑型研制
　　根據所篩選的最適碳氮源、固態發酵基質及正交試驗優化的最佳培養條件進行菌劑的研制。在羊糞∶麥麩=1∶1的固態發酵基質中按質量分數加25.8%水、2%碳氮源（葡萄糖、硝酸鈉），121℃、30 min高溫高壓滅菌后，冷卻到室溫。每個白盆0.7 kg基質，接種菌液160 mL，攪拌均勻后用保鮮膜封口室溫培養。
　　將GD9菌劑按質量分數60%、黏土30%、膨潤土1%、糊精3%、聚乙烯醇6%的比例混合，按照一定的工藝，初步試驗探索得到穩定性強、可均勻分散的易溶于水的可濕性粉劑。
　　3 結論與討論
　　本試驗通過對具有除草活性的菌株GD9的活化，最適碳氮源、固態發酵基質、載體的篩選以及采用正交試驗優化培養條件。得出以下結論：
　　以菌落直徑和孢子懸浮液OD值為指標篩選最適碳氮源以及載體和助劑，篩選出最適碳源為葡萄糖，最適氮源為硝酸鈉，最適載體及助劑為黏土、聚乙烯醇、膨潤土、糊精。
　　用菌落計數法和孢子懸浮液OD值測定法對最適固態發酵基質和最優培養條件的篩選中，篩選出最適固態發酵基質為羊糞;影響菌株GD9固態發酵條件的因素作用由大到小依次為：氮源>碳源>初始含水量>培養溫度>接種量>初始pH>培養時間。菌株GD9的最佳固態發酵條件為：氮源硝酸鈉58.4 mg/g、碳源葡萄糖48.4 mg/g、初始含水量258 mg/g、接種量0.26 mL/g、初始pH7.6、培養時間147.8 h、培養溫度30.7℃。
　　生防菌固態發酵基質的選取一般都是容易獲得、價格低廉的農副產品下腳料，在農業生產上既綠色、無公害，又可保護環境，符合農業可持續發展的要求[14]。本研究中生防菌株GD9的固態發酵適用于大批量生產，得到的菌劑易保存，方便儲存和運輸。
　　微生物除草劑的開發應用比化學農藥的開發存在更大的難度，其藥效受外界環境影響很大，所以選擇合適的載體助劑是生物農藥開發的關鍵。生物農藥助劑的功能，就在于改善農藥的一些物理或化學性能，最大限度地發揮藥效及安全施藥[15]。
　　本試驗已篩選出了最適合的載體及助劑，后續試驗可將GD9菌劑60%、黏土30%、膨潤土1%、糊精3%、聚乙烯醇6%的比例進行混合，按照一定的工藝，初步試驗探索得到穩定性強、可均勻分散的易溶于水的可濕性粉劑。最終篩選研制出防除效果較好的除草劑劑型，為微生物除草劑的研究提供理論依據。
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