土生鱗傘液體發酵工藝條件的優化研究
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摘 要：為了提高土生鱗傘菌絲體的產量，在單因素試驗基礎上，考察培養溫度、搖床轉速、培養時間和培養基起始pH對菌絲體干質量的影響，并通過Box-Behnken試驗設計和響應面分析法確定土生鱗傘液體發酵最佳工藝條件，對影響土生鱗傘（Native scale umbrella）菌絲生長的關鍵影響因子最佳水平范圍進行研究和探討。結果表明，土生鱗傘菌絲產量發酵培養條件的最佳組合是：溫度25℃，搖床轉速180r/min，培養時間9d，pH7，菌絲產量實測值為40.332g/100mL。此研究結果可為土生鱗傘液體發酵的試驗生產提供理論依據。
關鍵詞：土生鱗傘;響應曲面法;優化;發酵
中圖分類號 X523 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）09-0029-5
Abstract：In order to increase the mycelium yield of Umbrella lucidum，the effects of initial pH，culture time，rotating speed of shaker and culture temperature on the mycelium dry mass were investigated on the basis of single factor experiment.The optimum technological conditions of liquid fermentation of Umbrella lucidum lucidum were determined by Box-Behnken design and response surface methodology.The optimum level range of the key factors affecting the mycelial growth of ative scale umbrella was studied and discussed.The results showed that the mycelial yield of native umbrella was fermented.The optimum combination of culture conditions was （100 mL）： pH;temperature;rotating speed of shaker;culture time;measured value of m ycelium yield.The mycelium yield of the optimized native umbrella was higher than that before optimization.The results could provide theoretical basis for the experimental production of liquid ferme ntation of native umbrella.
Key words：Native scale umbrella;Response surface method;Optimize;Fermentation
絕大數真菌活性物不僅留存在子實體，也可留存在發酵液和菌絲體中，特別是高等擔子菌已變為人們探求新活性物的一個主要來源[1]。土生鱗傘（Native scale umbrella）又名地鱗傘，鱗環銹傘等，該菌種的主要特征為：子實體小型，叢生;菌蓋表面淡褐色;反卷較大的暗色鱗片在菌中部;菌肉為淺茶色至茶色的厚片，味道與氣味平淡。有關傘菌能夠增強免疫力、抗氧化和抗癌存在一部分的報道[2]，本實驗采用Box—Behnken響應曲面法聯合優化液體發酵培養基，通過改進土生鱗傘菌的培養條件進一步優化菌落，調節培養溫度、轉速、培養時間和初始pH，探究土生鱗傘液體發酵的最適條件，為土生鱗傘液體發酵的最佳生產供給理論依據。
1 材料和方法
1.1 供試菌種 土生鱗傘。
1.2 儀器 電子天平（JA51001型）：上海天美天平儀器有限公司;酸度計（PHS-3C型）：上海精密科學儀器有限公司;恒溫搖床（HNY-211C型）：天津歐諾儀器股份有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9030A型）：上海一恒科技有限公司;BBS-DDC型超凈工作臺：山東博科科學儀器有限公司;搖瓶;培養皿等玻璃器皿。
1.3 試劑材料 葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaOH、HCl。
1.4 培養基 PDA斜面培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL。首先將土豆除皮后切開，煮至沸騰約20min，用干凈紗質布料過濾后加入葡萄糖與瓊脂[3]，溶化以后補水到1000mL，在121℃條件下[4]滅菌20min。
完全培養基（CM）：蛋白胨1.0%，葡萄糖2.0%，酵母膏0.2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.1%，pH值未調節。
1.5 方法
1.5.1 菌種的活化 將土生鱗傘菌養育在PDA斜面培養基于4℃冰柜內留存，傳代1次時長為30d。菌苗傳代或活化菌苗步驟為：取土生鱗傘菌絲塊接種于PDA斜面培養基上，25℃條件養育7d[5]。取5塊長寬約2cm菌塊在培養基上（裝液量為100mL/250mL），靜止培養24h，再以轉速180r/min震蕩培養7d。將培育成功的土生鱗傘種子液按實驗設計的接種比例加入至發酵培養基內（100mL培養液裝入250mL搖瓶，加入10%的一級種子液，將轉速調為180r/min，26～27℃條件下培育5～6d），進行相應的優化實驗[6]。 1.5.2 培養溫度 將最適培養液100mL添加進250mL搖瓶，121℃高溫滅菌20min，再接入10%的一級種子液，存放于恒溫搖床上，溫度設成22、25、28、31、34℃，每個溫度設3組相同，培養9d后測定菌絲體產量，得出最適的培養溫度[7]。
1.5.3 轉速 將最適培養液100mL添加至250mL搖瓶，121℃高溫滅菌20min，再接入10%的一級種子液，放于恒溫搖床上，轉速設成120、150、180、210、240r/min，每個轉速設3組相同，培養9d后測定菌絲產量，得出最適的轉速[8]。
1.5.4 培養時間 將最適培養液100mL添加至250mL搖瓶，121℃高溫滅菌20min，再接入10%的一級種子液[8]，放置于恒溫搖床上，培養時間設成5、7、9、11、13d，每個培養時長設3組相同，培養9d后測定菌絲產量，得出最適的培養時間。
1.5.5 起始pH 將最適培養基100mL添加至250mL搖瓶，121℃高溫滅菌20min，再接入10%的一級種子液[8]，用10%的NaOH和HCl調節培養基的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，每個pH設3組相同，培養9d后去測菌絲產量，得出最適的培養pH。
1.5.6 土生鱗傘培養條件的Box—Behnken試驗設計 優化土生鱗傘液體發酵采取響應面曲線法，由單要素的實驗成果，使用Design—expert8.0.6軟件系統，Box- Behnken響應面法，自變量是培養溫度、轉速、培養時間和起始pH[9]，響應值是菌絲體干重，為擬和因素與指標間函數的關系，設計4因素3水平的二次回歸方程，具體試驗設計見表1，確定有關土生鱗傘液體發酵培養的最佳工藝。
1.5.7 菌絲體干重的測定 在結束養育后，用300目的濾網過濾100mL發酵液，用蒸餾水多次洗滌過濾菌絲球后[10]，在恒溫鼓風干燥箱內干燥，用天平稱取重量即得菌絲重。
2 結果與分析
2.1 溫度對土生鱗傘菌絲體量的影響 由圖1可知，菌絲體成長在不同培養溫下有差異，隨著溫度的增加土生鱗傘菌絲產量不斷增多[11]，到最高重量36.10g/100mL時為25℃，之后隨溫度上升，菌絲產量下降，菌絲體產量最少是在31℃，說明25℃最有利于土生鱗傘菌絲體的生長。
2.2 轉速對土生鱗傘菌絲體量的影響 由圖2可知，在不同轉速下菌絲體生長存在差異，轉速在150r/min菌絲體干重最大為37.14g/100mL，可能是因為含氧量在發酵中對土生鱗傘菌絲的成長有影響[11]，在一定轉速水平，轉速越大，菌液中溶氧量越高，越有利于菌絲生長;但轉速過大又會破壞菌絲結構，影響其生長。在150r/min時，土生鱗傘發酵的菌絲體干重最重。
2.3 培養時間對土生鱗傘菌絲體量的影響 由圖3可知，不同培養時間菌絲體生長在存在差異，養育9d菌絲體干質量達到最大25.30g/100mL;說明土生鱗傘菌絲體的干重隨發酵時長增加呈現增多的改變[12]，9d為選擇的最佳培養時間。
2.4 起始pH土生鱗傘菌絲體干重的影響 由圖4可知，在不同起始pH下菌絲體成長有差異，培養起始pH為6，菌絲體干質量最多為25.5g/100mL;說明在一定的pH范圍內，土生鱗傘干重隨pH的增加而增多[13]，pH為6是最佳養育起始pH。
2.5 Box—Behnken試驗設計
2.5.1 模型的建立與顯著性檢驗 由單要素試驗的結果，選4個要素分別是培養溫度、轉速、培養時間和起始pH，通過4要素3水平Box—Behnken實驗和響應面法。設計29組實驗，估計試驗誤差采取5次中心試驗，表2是具體組合和試驗值。菌絲體干重（Y）為響應值，Design Expert多元回歸擬合分析，如下多元二次回歸方程表示各要素對響應值影響：菌絲產量Y=+29.04+6.40×A+1.59×B+5.63×C+5.50×D-3.35×A×B+6.47×A×C+8.02×A×D+5.41×B×C+3.06×B×D+4.89×C×D-2.10×A2-10.81×B2-4.65×C2-7.87×D2
土生鱗傘菌絲體干重整體模型P<0.01，顯示該二次方程模型是極顯著水平，說明該方程對試驗擬合較好。根據回歸方程，做出響應曲面，考察擬合響應曲面的形狀，分析培養溫度、轉速、培養時間和起始pH對土生鱗傘菌絲體的影響，結果見圖5。
2.5.2 最佳工藝條件的預測與檢驗 土生鱗傘液體發酵最佳工藝由回歸模型預測：菌絲產量最大值為40.332g/100mL時，培養溫度為25℃，轉速為150r/min，培養時間為9d和起始pH為7。為檢驗最佳工藝條件的可靠性，培養前提同上后，進行驗證試驗，得菌絲體的實際值為40.247g/l00mL，說明二次回歸方程與實踐情況擬合較好。
3 結論
通過單因素試驗和Box—Behnken試驗以及用響應面分析法建立的菌絲體干重與各單個要素間關系的回歸模型，土生鱗傘液體發酵最佳條件是：溫度25℃，轉速180r/min，培養時長9d，pH7;菌絲干質量最重，為40.322g/100mL。對于各要素變量的二次回歸方程模型來說，該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好，有一定使用價值，為土生鱗傘菌絲體生物活性的提取奠定了一定的基礎。
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基金項目：2017年地方高校省級大學生創新創業訓練計劃項目（201711305071）;2018年安徽省教育廳自然科學研究重點項目（KJ2018A0570）;2016年安徽省質量工程項目大學生創客實驗室建設計劃（2016ckjh118）。
作者簡介：秦靜（1998—），女，安徽泗縣人，研究方向：食品生物技術。 *通訊作者 收稿日期：2019-03-30
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