京墨中有害元素的含量測定及揮發油成分分析

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　　【摘 要】 目的：測定京墨藥材中砷、鉛、鎘、鉻、銻、銅、汞7種有害元素的含量，對京墨藥材揮發油成分進行定性分析。方法：京墨樣品經微波消解后，以電感耦合等離子體-原子發射光譜法（ICP-AES）測定京墨中砷、鉛、鎘、鉻、銻和銅元素含量，以原子熒光光度法測定汞元素含量;用水蒸氣蒸餾法制備京墨揮發油樣品，GC-MS定性分析京墨藥材揮發油成分。結果：微波消解后ICP-AES測定方法線性關系、精密度和重現性良好，回收率為86.70 %～104.37 %，RSD均≤5.0 %;揮發油中鑒定出7種稠環芳烴類化合物。結論：根據中國《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》規定，京墨藥材中重金屬存在超標現象;京墨揮發油成分中主要為多環芳烴類化合物，大多具有致癌性及致畸性。
　　【關鍵詞】 京墨;重金屬;揮發油;ICP-AES;微波消解;GC-MS;多環芳烴
　　【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）3-0034-04
　　Abstract： Objective To establish analysis methods for determination of 7 heavy metals （As、Pb、Cd、Cr、Sb、Cu、Hg） and identification volatile oil constituents in fragrant ink. Method After microwave digestion， the contents of As， Pb， Cd， Cr， Sb and Cu in fragrant ink were determined by ICP-AES， and Hg was determined by atomic fluorescence spectrometry. The volatile oil samples of fragrant ink were prepared by steam distillation， and the constituents were qualitatively analyzed by GC-MS. Results The methods have good linearity， precision and reproducibility. The recovery after microwave digestion was 86.0%～104.37%， RSD was less than 5%. Seven kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons were identified in volatile oil. Conclusion The contents of heavy metals in fragrant ink were above the limit prescribed in China’s “Green Trade Standards Importing & Exporting Medicinal plants & Preparation”. The main components of volatile oil in fragrant ink are polycyclic aromatic hydrocarbons， most of which are carcinogenic and teratogenic.
　　Keywords：Fragrant Ink; Heavy Metals; Volatile Oil; ICP-AES; Microwave Digestion; GC-MS; Polycyclic Aromatic Hydrocarbons（ PAHs）
　　京墨又稱“京香墨”、“青墨”或“香墨”，由松煙末和膠質制成。京墨藥用歷史悠久，首載于唐代《本草拾遺》[1]，同時京墨也是常用藏藥[2]。經由歷代各民族本草記載可知京墨味辛，性溫，無毒，歸肝、腎經[3-4]。其藥用功效豐富，不僅可止血消腫，還能治鼻衄、產后血暈、飛絲入目等，現代研究表明京墨亦可用于治療帶狀孢疹[5-6]。微量元素在人體中的含量直接影響人體生理功能，與機體的活動狀態及疾病密切相關[7]，藥物中過量的微量元素尤其是重金屬的含量超標會損害人的健康，需要制定嚴格的標準來限制[8]。京墨作為傳統口服類藥物，目前有關京墨的各項質量控制標準均未見研究報道。而當今制墨所用的原料與工藝與古制京墨皆有差別[9-10]。為保證京墨的品質及入方藥用安全，本試驗以電感耦合等離子體-原子發射光譜法（ICP-AES法）測定7批京墨樣品中Sb、As、Pb、Cr、Cd、Cu元素的含量，并以原子熒光光度法測定其中Hg元素含量;同時以GC-MS法對京墨中的揮發油化學成分的組成進行分析，為規范完善京墨的質量控制標準及臨床應用提供科學依據。
　　1 儀器與材料
　　1.1 材料 京墨藥材（批號：JM1、JM2、JM3、JM4、JM5、JM6、JM7，四川天利和藥業有限公司和安徽徽州）。鎘標準液（批號：GSB 04-1721-2004）、鉻標準液（批號：GSB 04-1723-2004（a））、銻標準液（批號：GSB 04-1735-2004（a））、銅標準液（批號：GSB 04-1725-2004）均購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心;鉛標準液（批號：211035050）、汞標準液（批號：212075009）購于美國Accu Standard公司;砷標準液（批號：00009335632）購于美國Agilent Technologies公司。以上7種元素標準液標準值均為1000μg /mL。鹽酸、過氧化氫溶液均為分析純試劑（成都市科隆化學品有限公司），硝酸溶液為優級純試劑（天津市科密歐試劑公司），正己烷（天津科密歐化學試劑有限公司，色譜級），無水乙醚（四川西隴化工有限公司），無水硫酸鈉（成都金山化學試劑有限公司）。 　　1.2 儀器 BSA224S精密電子天平（Sartorius），TGL-16可控調溫電爐（四川蜀科儀器有限公司），EG37A plus微控數顯電熱板（Lab Tech），BHW-09A型消解儀（上海博通化學科技有限公司），微波消解儀（Anton Paar），Optima 8000電感耦合等離子體-原子發射光譜儀（Perkin Elmer）Agilent 7890B-5977A氣質聯用儀（美國），AL140電子天平（瑞士Metter Toledo公司），揮發油蒸餾裝置。
　　2 含量測定
　　2.1 供試品的制備 以微波消解法前處理京墨樣品。差減法精密稱取JM1樣品粉末0.3000g于聚四氟乙烯消解管中，加入硝酸-30 %過氧化氫（體積比為4∶1）的混合酸5mL，放入消解儀中于120 ℃預消解2h。取出后補加2mL硝酸，移入密封罐中置于微波消解系統中按照程序進行消解。消解完畢后，以超純水轉移至100mL容量瓶中定容并過濾，所得濾液即為供試品溶液。同法制備試劑空白溶液。微波消解系統程序見表1。
　　2.2 方法學考察
　　2.2.1 標準工作曲線及檢出限 以1 %硝酸溶液系列稀釋配制相應濃度的砷、鉻、銻、鎘、鉛、銅的混合標準液;以1 %硝酸溶液系列稀釋配制汞的單獨標準液。對試劑空白進行11次測定[11]，以待測元素響應值的3倍標準偏差除以標準曲線斜率，即可得該元素的方法檢出限。各標準液的標準曲線、R2值及檢出限。結果見表2。
　　2.2.2 精密度試驗 取JM1樣品的供試品溶液分別連續測定6次。測定各元素RSD范圍均在1.42 %～ 2.66 %之間。
　　2.2.3 重復性試驗 取JM1樣品，平行6份，按“2.1”項下的前處理方法進行樣品消解，得到6份供試液。測定各元素RSD范圍均在1.27 %～ 4.11 %之間。
　　2.2.4 穩定性試驗 取JM1樣品的微波供試品溶液，每隔4h測定一次共測6次。測得溶液中各RSD范圍均在0.96 %～ 4.91 %之間。表明該消解方法所得的供試品溶液在24h內穩定性良好。
　　2.2.5 加樣回收試驗 對已知含量的JM1京墨樣品作加樣回收試驗。按“2.1”項下的前處理方法進行樣品消解，得到6份供試液作回收率試驗。由表3可得微波消解測定7種元素的回收率在86.70 %～104.37 %之間，RSD≤4.87 %。表明該方法均準確可靠。
　　2.3 樣品測定 精密稱取7批次的京墨樣品，按“2.1”項下兩種方法制備供試品溶液，平行3次。以ICP-AES法測Sb、As、Pb、Cr、Cd和Cu元素的含量，以原子熒光光度法測Hg元素含量。其中7個樣品所得供試品溶液中As元素均低于檢測限，未被檢出。其余重金屬含量測定結果見表4。
　　以項目超標率=項目超標數/項目總數×100 %，比較所測不同廠家不同批號京墨藥材的7種有害元素情況[12]。所測京墨藥材重金屬超標率為As：0 %，Pb：71.43 %，Cr：100 %，Cd：0%，Sb：100 %，Cu：71.43 %，Hg：0 %。因京墨藥材不同廠家間及同廠家不同批號間存在沒有規律的差異，推測可能為原材料引入了重金屬，也可能是生產、運輸過程中引入污染。
　　根據《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》[13]中規定鉛（Pb）≤5.0mg/kg、鎘（Cd）≤0.3mg/kg、汞（Hg）≤0.2mg/kg、銅（Cu）≤20.0mg/kg、砷（As）≤2.0 mg/kg，可知京墨中Pb和Cu存在超標現象。各種相關標準中缺少對中藥材重金屬Cr及Sb的限量要求。因此參考《食品中污染物限量》[14]中最大限量規定鉻（Cr）≤2 mg/kg，可知Cr約超過限量指標145倍，超標現象尤為嚴重。根據世界衛生組織（WHO）規定每人每天可以耐受的Sb攝入量（TDI）為6.00μg/ kg[15]，因此京墨每日攝入量的參考值為0.0019μg，少于實際用量，可見京墨藥材中Sb也存在超標現象。但由于樣品來源不同，而且藥品相較于食品的攝入量也存在較大差異，因此其限量的指標限定還需進一步研究探討。
　　3 揮發油GC-MS定性分析
　　3.1 實驗參數及分析條件 載氣為氦氣，純度99.995 %，分流比為2∶1。升溫程序為初始溫度70℃，維持3min，以5℃/min的升溫速率升至120℃，維持10min。再以5℃/min的升溫速率升至220℃，維持15min。進樣量1μL，溶劑延遲4min。進樣口溫度280℃，接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃。電離方式為EI;電子能量70eV，電子倍增1.3kV。MS采集模式為掃描。質量掃描范圍在33～500amu間。譜庫為NIST 11.L，匹配度大于80%的質譜圖并且排前3 位的均為同一種物質或同分異構體的，則可定性為該種物質，小于80%的認為不能確定。
　　3.2 供試液溶液制備 將京墨樣品粉末過二號篩。差減法精密稱取京墨粉末3g，放在500mL燒瓶中，加水300mL與玻璃珠數粒，振搖混合。按《中國藥典》2015版第四部通則2204中的揮發油測定法的甲法，水蒸氣蒸餾5h至收集器中油量不再增加后停止加熱后放置1h。用乙醚將揮發油從測定裝置中轉移出來，加入無水硫酸鈉除去殘余水分，0.45μm微孔濾膜過濾后，得到具有特殊香味的油狀物，備用。
　　 3.3 結果及分析 對比7個樣品的總離子流色譜圖可得，所有樣品的峰均可在JM3樣品色譜圖中找到，因此該批次樣品具有代表性，以其為研究對象進行分析。JM3京墨樣品揮發油GC-MS總離子流色譜圖見圖1。由儀器工作站數據庫NIST 11.L自動生成的鑒定數據可見表5，7個主要色譜峰所代表的化合物均為多環芳烴，這7個化合物的毒性數據如表5所示。由實驗結果及毒性數據分析可得京墨揮發油主要成分包括Acenaphthylene、Fluorene、Phenanthrene、4H-Cyclopenta（def）phenanthrene、Fluoranthene、Pyrene等7 個化合物，其中Acenaphthylene為擬副交感神經系統藥，其余6 種具有致癌性及致畸性。 　　4 討論
　　 實驗以微波消解前處理結合ICP-AES對京墨7種有害元素進行含量測定。微波消解具有自動化程度高、試劑用量少、可實現無人看守等優點，且其操作環境密閉，元素揮發損失較少，有效避免了因操作與外界接觸而增加樣品污染可能性的問題[16-17]。檢測結果表明京墨藥材中鉛、銅、鉻、銻及重金屬總量存在超標現象，應規范其臨床使用劑量。
　　 實驗還對京墨中的揮發油化學成分的組成進行分析，結果表明京墨揮發油中7個主要化學成分均為多芳烴，推測是在制備墨粉原料的過程中植物高溫缺氧條件下不完全燃燒的產物，或者是植物本身含有的成分[18-19]，這些化合物均具有致癌性、致畸性。綜合京墨中重金屬含量及揮發油組成的毒性數據文獻，建議對其用藥入方謹慎對待。
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