HPLC測定四川梓潼產葛根和粉葛中四種異黃酮含量的分析

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　　摘要：采用YMC-Pack ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）測定四川梓潼產葛根和粉葛中4種異黃酮（葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元）含量。結果測得葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的線性范圍分別為0.050～0.750、0.010～0.150、0.010～0.150和0.012～0.180 μg，線性關系良好（r>0.999），平均加樣回收率為96.52%～100.22%，RSD為0.75%～1.84%。該方法簡便、準確、重現性好，適用于葛根中異黃酮含量的測定。梓潼產葛根中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量明顯高于粉葛，且梓潼產葛根和粉葛中大豆苷元含量明顯高于其他產地的葛根和粉葛。
　　關鍵詞：葛根;粉葛;高效液相;異黃酮;含量
　　中圖分類號：O657.7+2         文獻標識碼：A
　　文章編號：0439-8114（2019）09-0114-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.027           開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
　　Abstract： To determine the contents of four isoflavones of Pueraria lobata and Pueraria thomsonii in Sichuan Zitong by HPLC. The chromatographic conditions were YMC-Pack ODS-A C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）. The linear range of puerarin， 3′-methoxy puerarin， daidzin and daidzein were 0.050～0.750， 0.010～0.150， 0.010～0.150 and 0.012～0.180 μg， respectively， and it showed a good linear relationship（r>0.999）， the average recovery rate was between 96.52%～100.22%， and RSD was between 0.75%～1.84%（n=6）. This method is simple， accurate and reproducible. It is suitable for the determination of isoflavones in Puerarin. The contents of 4 isoflavones of P. lobata are obviously higher than P. thomsonii from Zitong， Sichuan Province. And the content of daidzein in P. lobata and P. thomsonii from Zitong is obviously higher than other habitat origins reported.
　　Key words： Pueraria lobata; Pueraria thomsonii; HPLC; isoflavone; content
　　葛根和粉葛分別來源于豆科葛屬植物野葛[Pueraria lobata （Willd.） Ohwi]和甘葛藤[Pueraria thomsonii Benth]的干燥根[1]，味甘、辛、涼，歸脾、胃經，具有解表退熱、生津、透疹、升陽止瀉之功效[1-3]，均含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類活性成分，但由于基源不同，兩者所含活性物質的量存在一定差別[4-6]，《中華人民共和國藥典》從2005年版開始也將葛根和粉葛作為兩個品種分開[7-9]。
　　葛根和粉葛在四川分布廣泛，梓潼縣為“5.12”地震受災區，災后重建過程中當地藥農在政府幫扶和支持下大量種植葛根和粉葛，但其主要藥效成分的含量未見報道。本研究采用HPLC法，以葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元為指標，對梓潼產葛根和粉葛藥材進行了質量評價，為當地兩種藥材的品質評價和資源利用提供參考。
　　1  材料與方法
　　1.1   材料
　　試驗所用葛根和粉葛藥材于2016年12月采自四川梓潼縣富庫葛根專業合作社種植基地，經西南交通大學生命科學與工程學院宋良科副教授鑒定為豆科植物野葛和甘葛藤的干燥根。
　　1.2  儀器與試藥
　　Agilent 1260 Infinity Series高效液相色譜儀;XY-200型高速多功能粉碎機（浙江省永康市松青五金廠）;BSA124S電子天平，十萬分之一（德國賽多利斯集團）;SK7200LH超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）;UPR-11-10T超純水器。
　　葛根素（批號為110752-200912）、大豆苷（批號為111738-200501）、大豆苷元（批號為111502-200402）對照品購于中國食品藥品檢定研究院;3′-甲氧基葛根素（批號為MUST-13092410）對照品購于成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇為色譜純，水為超純水（自制）。
　　1.3  方法
　　1.3.1  供試品溶液的制備  精密稱取梓潼葛根和粉葛粉末（過3號篩）0.1 g，置于圓底燒瓶中，精密加入50 mL 30%乙醇，稱定質量，超聲處理1 h，放冷，再稱定質量，用30%乙醇補足失重，搖勻，0.45 μm微孔膜過濾，取續濾液，即得。 　　1.3.2  混合對照品溶液的制備  分別精密稱取葛根素、3'-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元對照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻。精密移取0.5 mL，置于5 mL量瓶中，甲醇定容，使其質量濃度分別為50.00、10.00、10.00、12.00 μg/mL，保存于4 ℃冰箱中，備用。
　　1.3.3  色譜條件  YMC-Pack ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，25% B;10～35 min，25%～44% B;35～40 min，44%～49% B;40～45 min，49%～60% B;45～55 min，60%～25% B）;流速1.0 mL/min;柱溫22 ℃;檢測波長254 nm;進樣量10 μL。
　　2  結果與分析
　　2.1  HPLC色譜
　　HPLC色譜見圖1。
　　2.2  線性關系考察
　　吸取“1.3.2”項下混合對照品溶液1、2、6、10、 15 μL，在“1.3.3”色譜條件下進樣，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標進行線性回歸[10]，結果見表1。
　　2.3  精密度試驗
　　精密吸取“1.3.2”項下混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，測得葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面積RSD分別為1.77%、2.06%、1.44%、1.50%，表明儀器精密度良好。
　　2.4  穩定性試驗
　　取同一供試品適量，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“1.3.3”項色譜條件下測定，記錄色譜圖，測得葛根的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面積RSD分別為1.28%、1.64%、1.68%、0.55%;粉葛的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元峰面積RSD分別為2.09%、1.77%、1.06%、0.62%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。
　　2.5  重復性試驗
　　取葛根和粉葛藥材各3份，精密稱定，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，在“1.3.3”項色譜條件下測定，記錄色譜圖，測得葛根的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元含有量RSD分別為0.85%、0.56%、1.93%、0.40%;粉葛的葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元含有量RSD分別為1.31%、1.35%、1.37%、0.70%，表明該方法重復性良好。
　　2.6  加樣回收試驗
　　精密稱取葛根和粉葛藥材各3份，每份0.06 g，精密加入葛根素（1.98 mg/mL）對照品溶液2 mL、3′-甲氧基葛根素（0.10 mg/mL）對照品溶液1 mL、大豆苷（0.20 mg/mL）對照品溶液1 mL、大豆苷元（0.13 mg/mL）對照品溶液1 mL，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，計算加樣回收率。結果見表2。
　　2.7  樣品含量測定
　　稱取梓潼產葛根和粉葛各3份，按“1.3.1”的方法制備供試品溶液，在“1.3.3”色譜條件下測定，結果見表3。由表3可知，梓潼產葛根中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量明顯高于粉葛中的含量，說明梓潼產葛根的品質優于粉葛。
　　3  討論
　　葛根和粉葛在中國南方地區分布廣泛，其中葛根是著名的藥食同源藥材。試驗采用甲醇-水溶液梯度洗脫法，能使葛根和粉葛中的幾類主要異黃酮化合物得到較好的分離。四川梓潼產葛根中葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量明顯高于粉葛中的含量，說明梓潼產葛根的品質優于粉葛;梓潼產葛根和粉葛中大豆苷元的含量明顯高于文獻報道的其他產地的葛根和粉葛[10-12]，可為四川梓潼產葛根和粉葛的品質評價及開發利用提供參考依據。
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　　收稿日期：2018-10-23
　　基金項目：國家重大科技專項（2013ZX09103002-014）;2017年中醫藥公共衛生服務補助專項[財社（2017）66號];四川省中醫藥管理局中醫藥科學技術研究專項（2016Q037）;大學生科研訓練計劃項目（2017093;201710613067）;第12期大學生個性化實驗項目（GX201812098）
　　作者簡介：徐煒鋒（1996-），男，浙江紹興人，在讀本科生，制藥工程專業，（電話）17713550530（電子信箱）524417896@qq.com;通信作者，蔣合眾（1980-），男，重慶銅梁人，副教授，博士，主要從事天然藥物化學研究，（電子信箱）jianghz10@sina.com。
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