HPLC法同時測定辣木葉顆粒中異槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的含量

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　　摘 要 目的：建立同時測定辣木葉顆粒中異槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B含量的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法。色譜柱為Cosmosil-C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.3 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為260 nm，進樣量為10 μL。結果：異槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B檢測質量濃度線性范圍分別為0.017～0.341、0.010～0.194、0.010～0.195 mg/mL（r均>0.999 0）；檢測限分別為0.085、0.143、0.117 μg/mL；定量限分別為0.283、0.476、0.392 μg/mL；精密度、穩定性（24 h）、重復性試驗的RSD均≤2.0%（n=6）；平均加樣回收率分別為101.22%、98.76%、98.72%，RSD分別為0.66%、0.30%、0.30%（n=6）。結論：建立的方法簡便、準確、重復性好， 可用于同時測定辣木葉顆粒中異槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的含量。
　　關鍵詞 辣木葉顆粒；高效液相色譜法；異槲皮苷；紫云英苷；丹酚酸B；含量測定
　　Simultaneous Determination of Isoquercitrin， Astragalin and Salvianolic Acid B in Moringa oleifera Leaves Granules by HPLC
　　YANG Haiyang1，LIU Yang1，LI Mengwei1，LI Xueyan1，HE Jun2，GU Wenhong2，YIN Jiyun2（1.College of TCM， Beijing University of TCM， Beijing 102488， China；2.Yunnan Tianyou Technology Co.， Ltd.， Yunnan Mangshi 678400， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of isoquercitrin， astragalin and salvianolic acid B in Moringa oleifera leaves granules. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Cosmosil-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at flow rate of 1.3 mL/min. The column temperature was 40 ℃ and detection wavelength was set at 260 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of isoquercitrin， astragalin and salvianolic acid B were 0.017-0.341， 0.010-0.194， 0.010-0.195 mg/mL， respectively （all r>0.999 0）. The detection limits were 0.085， 0.143， 0.117 μg/mL， and the limits of quantitation were 0.283， 0.476， 0.392 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. Average recoveries were 101.22%， 98.76% and 98.72%， and RSDs were 0.66%，0.30%，0.30% （n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The established method is simple， accurate and reproducible. It can be used for simultaneous determination of isoquercitrin， astragalin and salvianolic acid B in M. oleifera leaves granules.
　　KEYWORDS Moringa oleifera leaves granules； HPLC； Isoquercitrin； Astragalin； Salvianolic acid B； Content determination
　　辣木葉顆粒是根據《校注婦人良方》中天王補心丹組方制備而來，由辣木葉、酸棗仁、丹參、遠志、五味子5味中藥制備而成。其中，辣木葉是辣木科辣木屬辣木（Moringa oleifera Lam.）的干燥葉，具有改善睡眠的作用[1]；酸棗仁可養心肝之血，進而起到安神的作用，是治療失眠復方中使用最多的一味藥材[1-2]，具有鎮靜催眠[3]、對抗神經系統興奮[4]、寧心安神的作用；丹參具有活血涼血、養血安神的作用[5-6]；遠志具有交通心神、強志安神的作用；五味子具有斂心氣、養心陰的作用，與酸棗仁合用可養心除煩，鎮靜安神[7-8]。本課題組根據處方，制備辣木葉顆粒，然后采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定辣木葉顆粒中君藥辣木葉有效成分異槲皮苷、紫云英苷[9]和丹參中的丹酚酸B[10-11]的含量，以期為辣木葉顆粒的質量控制和進一步研究提供參考。 　　1 材料
　　1.1 儀器
　　LC-16 HPLC儀（日本島津公司）；SB-5200DT超聲波清洗儀器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；CPA225D電子分析天平（德國賽多利斯公司）；DZTW電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發儀（北京佳源興業科技有限公司）；DZ-2BC真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。
　　1.2 藥品與試劑
　　辣木葉（云南天佑科技開發有限公司，批號：160824）、遠志（批號：1702048）、五味子（批號：1702047）、丹參（批號：1701027）、酸棗仁（批號：1503009）均購自北京太陽樹康中藥飲片廠，經北京中醫藥大學中藥鑒定系張貴君教授鑒定為真品；異槲皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111809-201403，純度：92.9%）；紫云英苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y27J7H9634，純度：99.5%）；丹酚酸B對照品（上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號：ST00050120MG，純度：99.5%）；甲醇、磷酸為分析純，乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水。
　　2 方法與結果
　　2.1 辣木葉顆粒的制備
　　按處方量稱取辣木葉、酸棗仁、丹參、五味子、遠志適量，加入10倍量水回流提取2次，每次2 h，過濾，靜置過夜，濾去沉淀，旋轉蒸發濃縮至一定體積，得濃縮液；60 ℃水浴濃縮至浸膏，移置60 ℃真空干燥箱中減壓干燥，粉碎得干浸膏粉（得率為36.02%）。以乳糖為輔料，干浸膏粉與乳糖的質量比為1 ∶ 1，潤濕劑為80%乙醇適量，混合，制粒，干燥，即得辣木葉顆粒。本研究共制備6批樣品，批號分別為20170901、20170902、20170903、20170904、20170905、20170906。
　　2.2 色譜條件
　　色譜柱為Cosmosil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～16 min，20%A；16～30 min，40%A，30～36 min，20%A）；流速為1.3 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為260 nm；進樣量為10 μL。
　　2.3 溶液的制備
　　2.3.1 混合對照品溶液 取異槲皮苷10.56 mg、紫云英苷10.16 mg、丹酚酸B 10.23 mg，分別置于10 mL的量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得對照品貯備液。精密吸取異槲皮苷貯備液1.74 mL、紫云英苷貯備液0.94 mL、丹酚酸B 0.96 mL于5 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，即得混合對照品溶液。
　　2.3.2 供試品溶液 取辣木葉顆粒樣品 1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇溶液，稱質量；超聲（功率：250 W，頻率：33 kHz） 30 min后取出，放冷，稱質量，加入甲醇補足質量，搖勻，即得。
　　2.3.3 陰性對照品溶液 精密稱取乳糖1.0 g，并按“2.3.2”項下方法制備成辣木葉顆粒陰性樣品溶液。
　　2.4 專屬性試驗
　　取“2.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液（批號：20170901）、陰性對照品溶液適量，按“2.2”項下的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B與其他成分色譜峰均能完全分離，分離度均>1.5，理論板數以異槲皮苷計不低于13 000。高效液相色譜圖見圖1。
　　2.5 線性關系考察
　　將“2.3.1”項下的混合對照品溶液定量稀釋成含異槲皮苷0.017、0.034、0.051、0.068、0.085、0.128、0.171、0.341 mg/mL，紫云英苷0.010、0.019、0.029、0.039、0.049、0.073、0.097、0.194 mg/mL，丹酚酸B 0.010、0.020、0.029、0.039、0.049、0.073、0.098、0.195 mg/mL的系列濃度混合對照品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進樣分析，以待測成分質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，線性關系考察結果見表1。
　　2.6 檢測限與定量限考察
　　取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限。結果，異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的檢測限分別為0.085、0.143、0.117 μg/mL；異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的定量限分別為0.283、0.476、0.392 μg/mL。
　　2.7 精密度試驗
　　精密量取“2.3.2”項下供試品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果，異槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的峰面積的RSD分別為1.17%、1.37%、0.69%（n=6），表明儀器精密度良好。
　　2.8 穩定性試驗
　　精密量取“2.3.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、4、6、8、12 、24 h后，按照“2.2”的色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果，異槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B的峰面積的RSD分別為1.07%、1.67%、0.60%（n=6）。表明供試品溶液樣品在24 h內穩定性良好。
　　2.9 重復性試驗
　　精密稱取辣木葉顆粒（批號：20170901）1 g，按“2.3.2”項下方法制備樣品6份，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果，異槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.50%、0.54%、0.85%（n=6），表明該方法的重復性良好。 　　2.10 加樣回收率試驗
　　精密稱取辣木葉顆粒（批號：20170902）0.5 g，共6份，各加入約與樣品中異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B 3種成分含量相同的對照品于具塞錐形瓶中，再分別精密加入50 mL 70%甲醇溶液，按“2.3.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，異槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B平均加樣回收率分別為101.22%、98.76%、98.72%，RSD分別為0.66%、0.30%、0.30%（n=6）?；厥章式Y果見表 2。
　　2.11 樣品測定結果
　　精密稱取6批辣木葉顆粒的樣品約1 g，按“2.3.2”項
　　3 討論
　　本課題組在制備辣木葉顆粒的供試品溶液時，為了使操作更加快捷、節約溶劑和時間，筆者對提取方法（超聲提取和回流提?。?、提取溶劑（純甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、水）、提取時間（30、45、60 min）、提取次數（1、2、3次）進行綜合考察。結果表明，辣木葉顆粒用超聲提取和回流提取對待測成分提取率無影響，故優先選擇超聲提??；用70%甲醇提取的異槲皮苷和紫云英苷、丹酚酸B的提取率最高，故選擇70%甲醇為提取溶劑。提取時間30、45、60 min，提取次數也對待測成分提取率無影響，故優先選擇30 min提取1次。
　　筆者前期也對異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B進行全波長掃描，發現異槲皮苷的最大吸收波長為297 nm，丁香酚在362 nm和266 nm波長下有較大吸收，丹酚酸B在 254 nm和 287 nm波長下有較大吸收；最后綜合考慮3種指標成分色譜峰對稱因子、分離度、響應值、基線噪音，以及檢測方法對各含量范圍樣品的適用性、靈敏度等因素后，選擇260 nm作為同時檢測的波長。
　　綜上所述，本研究成功建立了同時測定辣木葉顆粒中異槲皮苷、紫云英苷和丹酚酸B含量的方法，且該法簡便、準確、重復性好，可為辣木葉顆粒的質量評價提供參考依據。
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