HPLC—雙波長切換法同時測定雙參通冠膠囊中脫氫紫堇堿、丹酚酸B的含量

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　　摘 要 目的：建立同時測定雙參通冠膠囊中脫氫紫堇堿和丹酚酸B含量的方法。方法：采用HPLC-雙波長切換法。色譜柱為Waters symmetry C18，以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為286 nm（丹酚酸B）、336 nm（脫氫紫堇堿），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。結果：在建立的檢測條件下，脫氫紫堇堿和丹酚酸B均能達到基線分離，二者進樣量線性范圍分別為 0.157～1.259 μg、0.391～3.131 μg（r均為0.999 9）；精密度、重復性和穩定性試驗（24 h 內）的RSD均小于2.00%（n=6～10）；平均加樣回收率分別為101.61%、102.85%（RSD分別為3.59%、2.85%，n=6）。結論：建立的 HPLC-雙波長切換法可同時測定雙參通冠膠囊中脫氫紫堇堿和丹酚酸B含量，且方法操作簡便、快速，可用于雙參通冠膠囊的質量控制。
　　關鍵詞 雙參通冠膠囊；HPLC-雙波長切換法；含量測定；丹酚酸B；脫氫紫堇堿
　　Simultaneous Determination of Dehydrocorydine and Salvianolic Acid B in Shuangshen Tongguan Capsules by HPLC-dual Wavelength Switching Method
　　SUN Jin，ZHANG Peng，PENG Qing，MENG Shuo，REN Junguo，LIU Jianxun（Institute of Basic Medical Sciences， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To develop an method for determining the contents of dehydrocorydine and salvianolic acid B in Shuangshen tongguan capsules simultaneously. METHODS： The HPLC-dual wavelength switching method was used. The determination was performed on Waters symmetry C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min， the detection wavelength was 286 nm （salvianolic acid B） and 336 nm （dehydrocorydine）. The column temperature was maintained at 25 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： Under this condition， dehydrocorydaline and salvianolic acid B could be separated in baseline. The linear range of them were 0.157-1.259 μg and 0.391-3.131 μg （r=0.999 9）. RSDs of precision， reproducibility and stability tests （within 24 h） were all lower than 2.00% （n=6-10）. The average recovery rates were 101.61% and 102.85% （RSD=3.59% and 2.85%， n=6）. CONCLUSIONS： Established HPLC-dual wavelength switching method can be used for simultaneous determination of dehydrocorydine and salvianolic acid B in Shuangshen tongguan capsules. The method is simple and rapid， and can be used for the quality control of Shuangshen tongguan capsule.
　　KEYWORDS Shuangshen tongguan capsules； HPLC-dual wavelength switching method； Content determination； Salvianolic acid B； Dehydrocorydine
　　雙參通冠膠囊是由人參、丹參、延胡索等中藥提取物以一定比例配伍而成的組分中藥，目前正處于臨床前研究階段。在該制劑中，人參大補元氣、養血生津，丹參活血、化瘀、消癰，延胡索行氣活血并具有良好的止痛效果，三藥配伍具有益氣活血、理氣止痛之效[1]。前期研究表明，三藥組成的方劑或制劑（原方曾用名有雙參通冠方、雙參寧心方、雙參寧心膠囊等）具有明顯改善動物急性心肌缺血和心肌梗塞的作用，能夠減輕心肌損傷程度、縮小心肌梗塞面積，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[2-4]；另還可擴張冠脈血管、降低冠脈阻力、增加冠脈血流量，從而改善心肌的供血供氧，對心血管系統起到調整和改善作用[5-6]。為有效地控制其內在質量，本實驗室前期建立了分別對其有效成分脫氫紫堇堿（延胡索）和丹酚酸B（丹參）進行含量測定的色譜方法，操作較煩瑣；為優化其測定方法，本文中通過切換波長、采用梯度洗脫，建立了同時測定雙參通冠膠囊中脫氫紫堇堿和丹酚酸B含量的方法，以期為其質量標準擬定提供依據。 　　1 材料
　　1.1 儀器
　　Agilent1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；METTLER AE240型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q型超純水儀（美國密理博公司）。
　　1.2 藥品與試劑
　　雙參通冠膠囊[本實驗室制備，批號：20180510（小試樣品），20180810、20180829、20180917（中試樣品），規格：160 mg/粒]；脫氫紫堇堿對照品（日本和光純藥工業株式會社，批號：045-32941，純度：85.53%）；丹酚酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111562-201716，純度：94.1%）；乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水。
　　2 方法
　　2.1 混合對照品溶液的制備
　　取脫氫紫堇堿、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含脫氫紫堇堿0.09 mg、丹酚酸B 0.2 mg的混合溶液，即得。
　　2.2 供試品溶液的制備
　　取雙參通冠膠囊10粒，倒出其內容物，研細，混勻。取細粉約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入80%甲醇，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz，10 min）處理使其溶解，定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。
　　2.3 陰性樣品溶液的制備
　　雙參通冠膠囊在制劑過程中加入了一定量的輔料糊精，為考察輔料和人參提取物對測定結果是否有干擾，按處方比例稱取適量輔料和人參提取物制成陰性樣品，按“2.3”項下方法制備陰性樣品溶液。
　　2.4 色譜條件與系統適用性試驗
　　色譜柱為Waters symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1. 0 mL/min；柱溫：25 ℃ ；進樣量：10 μL；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（V/V），梯度洗脫；檢測波長：0～30 min：336 nm（脫氫紫堇堿），30～60 min：286 nm（丹酚酸B）。在上述色譜條件下，取“2.1”“2.2”“2.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液（批號：20180510）和陰性樣品溶液進樣分析，結果脫氫紫堇堿和丹酚酸B理論板數均不低于20 000，相鄰峰之間分離度均大于1.5。梯度洗脫程序見表1，3種溶液的色譜圖見圖1。
　　2.5 方法學考察
　　2.5.1 線性關系考察與定量限試驗 精密吸取混合對照品溶液 2、4、6、8、10、12、14、16 ?L，注入液相色譜儀中，按照“2.1”項下色譜條件測定。分別以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，計算回歸方程。結果，脫氫紫堇堿、丹酚酸B的回歸方程分別為：y=330.12x-17.62（r=0.999 9）、y=252.31x-17.62（r=0.999 9），表明脫氫紫堇堿、丹酚酸B進樣量分別在 0.157～1.259、0.391～3.131 μg范圍內與其峰面積具有良好的線性關系。
　　以信噪比約10 ∶ 1時相應的質量濃度作為定量限進行試驗。結果表明，脫氫紫堇堿定量限為1.60 μg/mL（信噪比為9.8），丹酚酸B的定量限為5.18 mg/mL（信噪比為12.6）。
　　2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣 6 次。結果，脫氫紫堇堿、丹酚酸B峰面積的 RSD分別為0.54%、0.54%（n=6），表明儀器精密度良好。
　　2.5.3 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號：20180510），按“2.1”項色譜條件，分別于0、1、2、4、6、8、12、16、20、24 h進樣測定，讀取各成分峰面積值。結果，脫氫紫堇堿、丹酚酸B峰面積的 RSD分別為 0.79%、0.68%（n=10），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。
　　2.5.4 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：20180510）共6份，按“2.3”項下方法制備成供試品溶液，依法獨立測定，計算樣品中脫氫紫堇堿、丹酚酸B含量，結果含量的RSD分別為2.00%、1.82%（n=6），表明該方法重復性良好。
　　2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量樣品（批號：20180510）共6份（脫氫紫堇堿21.01 mg/g、丹酚酸B 49.37 mg/g），分別精密加入對照品適量，依法測定，結果表明本法準確度較好，方法可行，詳見表2。
　　2.6 樣品含量測定
　　取3批中試樣品（批號分別為20180810、20180829、20180917），依法制備成供試品溶液，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算含量，并與本試驗室前期建立的分別測定2種成分含量（各測定波長均分別與本法相同）的結果進行比較，詳見表3。
　　3 討論
　　3.1 測定成分的選擇
　　丹參藥材中含有水溶性的酚酸類成分和脂溶性的丹參酮類成分，而研究發現對于冠心病的治療，其中水溶性部分更為重要，而丹酚酸B是水溶性物質中活性最強的成分[7]；另外，2015年版《中國藥典》（一部）也以丹酚酸B為指標對丹參藥材進行質量控制。延胡索中的主要化合物為生物堿，其中叔胺類生物堿約占0.65%，季胺類生物堿約占0.3%[8]。2015年版《中國藥典》以延胡索乙素（叔胺類生物堿）作為指標性成分對延胡索藥材進行質量控制，但在延胡索中還同時含有季胺類生物堿如脫氫紫堇堿。研究表明，叔胺類生物堿延胡索乙素是延胡索鎮痛的主要活性成分[9]，而季胺類生物堿在治療心血管疾病中具有重要作用[10]。結合本實驗室初期工藝篩選及藥效學實驗研究發現，延胡索含有的季胺類生物堿中以脫氫紫堇堿含量較高，并具有較好的藥理作用，所以最終決定選擇丹酚酸B和脫氫紫堇堿作為該制劑的指標性成分進行含量測定。 　　3.2 供試品制備方法的確定
　　本研究在前期試驗中，采用了單因素試驗對供試品溶液制備過程中的提取溶劑、提取時間和溶劑用量進行了考察。分別考察了不同體積分數（50%、80%、100%）的甲醇、乙醇（乙醇最高體積分數為95%）等溶劑的提取效果，結果表明采用 80%甲醇或80%乙醇為提取溶劑時各指標成分提取率均較高，純甲醇對丹酚酸B的提取有影響，導致提取率偏低；分別對不同提取時間（5、10、15、30 min）進行了考察，結果表明以 80%甲醇為溶劑，超聲提取10、15 min的提取率基本一致，且超聲提取 10 min 時有效成分基本提取完全，故選擇超聲提取 10 min；分別對提取溶劑用量為10、15、20 mL（樣品量為10 mg）時進行比較，結果表明使用10 mL溶劑量即可有效提取出各成分。故最終得到優化的提取方法為用80%甲醇10 mL超聲提取10 min。
　　3.3 色譜條件的選擇
　　在對中藥進行分析時，流動相選擇不當，常常會使峰形不佳[11]。本試驗需同時測定丹參中水溶性酚酸類成分和延胡索中生物堿類成分，2種成分性質相差較大，故最終采用梯度洗脫。在前期試驗中，筆者曾考察了乙腈-0.1% 磷酸溶液（三乙胺調pH至6）、乙腈-0.2%磷酸溶液（三乙胺調pH至4）、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.05%磷酸溶液等不同溶液組成的流動相[12-14]以不同比例進行對比試驗研究。結果表明，采用乙腈-0.05%磷酸系統較其他系統基線平穩、洗脫能力強，可以使各指標成分良好分離，峰形對稱，故確定乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫。在前期試驗中，對對照品溶液進行全波長掃描，結果發現丹酚酸B和脫氫紫堇堿分別在波長約286、336 nm處呈現最大吸收，與文獻報道相似[15-17]。因2種成分最大吸收波長差異較大，故本文采用波長切換法對雙參通冠膠囊中2種成分進行含量測定。
　　綜上，本試驗建立的 HPLC-雙波長切換法可同時測定雙參通冠膠囊中酚酸類成分丹酚酸B和生物堿類成分脫氫紫堇堿的含量，該方法簡單快速、重復性好，且在各組分適宜波長處分別測定其含量，使得測定結果更加準確。本法可作為雙參通冠膠囊含量測定方法，可為其質量控制和質量標準的建立提供參考。
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　　（收稿日期：2018-11-07 修回日期：2019-01-01）
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