刺梨不同藥用部位中鞣花酸的含量測定及其醇提物的體外抗氧化活性研究
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摘 要 目的：比較刺梨果、刺梨根和刺梨葉中3個藥用部位中游離鞣花酸與總鞣花酸含量，并評價刺梨不同藥用部位醇提物的體外抗氧化活性。方法：采用超聲提取和酸水解的方法分別得到刺梨不同藥用部位的游離鞣花酸和總鞣花酸，并使用超高效液相色譜法（UPLC）分別測定其含量。以半數清除濃度（IC50）為抗氧化活性為評價指標，對不同藥用部位醇提物進行1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2′ -聯氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基清除試驗，并以維生素C（VC）為陽性對照。結果：游離鞣花酸和總鞣花酸在刺梨藥用不同部位中的含量均存在明顯差異，游離鞣花酸含量高低順序為刺梨葉（38.49 mg/g）>刺梨果（20.59 mg/g）>刺梨根（11.35 mg/g），總鞣花酸含量高低順序為刺梨葉（197.08 mg/g）>刺梨果（49.36 mg/g）>刺梨根（21.86 mg/g），且刺梨果和刺梨根中總鞣花酸含量約為相應部位游離鞣花酸含量的2倍，刺梨葉中總鞣花酸含量約為相應部位游離鞣花酸含量的5倍。在DPPH自由基和ABTS自由基清除試驗中，抗氧化活性強弱順序均為VC>刺梨葉>刺梨果>刺梨根，并且刺梨葉[對DPPH自由基和ABTS自由基的IC50分別為（4.57±0.70）、（115.99±2.21） μg/mL]和刺梨果[對DPPH自由基和ABTS自由基的IC50分別為（5.12±0.24）、（127.61±3.31） μg/mL]的作用效果與VC[對DPPH自由基和ABTS自由基的IC50分別為（4.47±0.38）、（121.42±2.65） μg/mL]比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論：在刺梨果、刺梨根和刺梨葉3個藥用部位中，刺梨葉的游離（總）鞣花酸含量最高，并且其醇提物的體外抗氧化活性最強。
關鍵詞 刺梨果；刺梨根；刺梨葉；鞣花酸；超高效液相色譜法；酸水解；抗氧化活性
Study on Content Determination of Ellagic Acid in Different Medicinal Parts of Rosa roxburghii and in vitro Antioxidant Activity of Its Ethanol Extract
TAN Denghang1，WANG Pengjiao1，ZHANG Shuo2，ZHAO Mei3，LIU Yan1，ZHANG Min1，3，GAO Xiuli1，2，3（1.State Key Lab of Functions and Applications of Medicinal Plants/School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China；2.Experimental Animal Center， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China；3.Guizhou Provinical College of Microbiological and Biochemical Pharmacy Engineering Center， Guiyang 550025，China）
ABSTRACT OBJECTIVE： Compare the contents of free ellagic acid and total ellagic acid in fruits， roots and levels of Rosa roxburghii， and to evaluate the in vitro anti-oxidant activity of ethanol extract of three medicinal parts of R. roxburghii. METHODS： Free ellagic acid and total ellagic acid were obtained from different medicinal parts of R. roxburghii by ultrasonic extraction and acid hydrolysis， respectively. The contents of them were determined by UPLC. Using half-clearance value （IC50） as anti-oxidant evaluation index， free radical scavenging test of 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） and 2，2′ -binitro-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） （ABTS） were conducted for ethanol extract of different medicinal part， using vitamin C （VC） as positive control. RESULTS： There were significant differences in the content of free ellagic acid and total ellagic acid in different medicinal parts of R. roxburghii. The content level of free ellagic acid was in descending order： R. roxburghii leaves （38.49 mg/g）>R. roxburghii fruits （20.59 mg/g）>R. roxburghii roots （11.35 mg/g）； the content level of total ellagic acid was in descending order： R. roxburghii leaves （197.08 mg/g） > R. roxburghii fruits （49.36 mg/g） > R. roxburghii roots （21.86 mg/g）. The contents of total ellagic acid in the fruits and roots of R. roxburghii were twice as much as that of free ellagic acid in corresponding parts； the contnets of total ellagic acid in the leaves of R. roxburghii were five times higher than that of free ellagic acid in corresponding parts. In the DPPH free radical scavenging test and ABTS free radical scavenging test， the order of antioxidant activity was VC > R. roxburghii leaves>R. roxburghii fruits>R. roxburghii roots. There was no statistical significance in the effects of R. roxburghii leaves [IC50 to DPPH free radical and ABTS free radical were （4.57±0.70）、（115.99±2.21） μg/mL] and R. roxburghii fruits [IC50 to DPPH free radical and ABTS free radical were （5.12±0.24）、（127.61±3.31） μg/mL]， compared with the effects of VC [IC50 to DPPH free radical and ABTS free radical were （4.47±0.38）、（121.42±2.65） μg/mL] （P>0.05）. CONCLUSIONS： Among fruits， roots and leaves of R. roxburghii， the content of free （total） ellagic acid is the highest in the R. roxburghii leaves and in vitro anti-oxidant activity of its ethanol extract is the strongest. KEYWORDS Rosa roxburghii fruits； Rosa roxburghii roots； Rosa roxburghii leaves； Ellagic acid； UPLC； Acid hydrolysis； Anti-oxidant activity
刺梨（Rosa roxburghii Tratt）是一種藥食兩用的薔薇科植物，主要分布于我國西南部地區，其果、根和葉均為藥用部位，收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》[1]。其中，刺梨果可用于消食健脾、收斂止瀉，刺梨根可用于治療食積腹痛、牙痛、久咳、泄瀉、帶下等疾病，而刺梨葉可用于健胃消食[1]。刺梨果多與其他中藥材配伍，用于治療脾胃失調等疾病，而刺梨葉和刺梨根通常在產區內被遺棄，沒有得到合理的應用。
多酚類成分是刺梨的主要活性成分之一，而鞣花酸（又名并沒食子酸）作為沒食子酸的二聚衍生物，屬于多酚類成分，具有良好的抗癌、抗炎、抗氧化等作用[2-4]。在自然界植物中，以游離形式存在的鞣花酸較少，其主要以鞣花單寧或糖苷的形式存在，經過酸水解后釋放，得到總鞣花酸[5]。此前有文獻報道，采用超高效液相色譜串聯三重四級桿飛行時間質譜法（UPLC-Triple-TOF/MS）鑒定出了刺梨果中含有鞣花酸和3種鞣花酸糖苷[6]，但目前尚未見文獻對刺梨不同用藥部位中的鞣花酸含量進行測定。另有文獻采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2′ -聯氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基清除試驗，分別對刺梨葉、刺梨果乙醇提取物的體外抗氧化活性進行了研究[7-8]，但目前尚未見文獻報道刺梨根的抗氧化活性。在本研究中，筆者擬比較刺梨不同藥用部位（葉、果、根）中游離鞣花酸和總鞣花酸的含量高低，并對刺梨不同藥用部位醇提物進行體外抗氧化活性比較，為刺梨資源的有效利用提供參考。
1 材料
1.1 儀器
Agilent 1290型UPLC儀（美國Agilent公司）；UV- 2700型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）；KQ-300DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TB-215 D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。
1.2 藥品與試劑
刺梨果、刺梨根和刺梨葉均采自貴州省龍里縣，樣品經貴州醫科大學生藥學教研室龍慶德副教授鑒定分別為薔薇科植物R. roxburghii Tratt的果實、根和葉，樣品經自然風干后，粉碎，過40目篩，保存備用；鞣花酸對照品（批號：1013A023，純度：≥98%，供含量測定用）、維生素C（VC）對照品（批號：105N032，純度：≥98%）均由北京索萊寶科技有限公司提供；DPPH標準品（批號：W12A9E55779，純度：≥98%）、ABTS標準品（批號：K18N8M48402，純度：≥98%）均由上海源葉生物科技有限公司提供；乙腈（德國默克公司，色譜純）；甲酸（色譜純）、鹽酸（優級純）、二甲基亞砜（分析純）均購自天津科密歐化學試劑有限公司；甲醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。
2 方法與結果
2.1 鞣花酸含量測定
2.1.1 溶液的制備 （1）鞣花酸對照品溶液的制備：取鞣花酸對照品適量，精密稱定，加流動相制成質量濃度為0.4 mg/mL的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，于4 ℃保存，備用。（2）測總鞣花酸供試品溶液的制備：參考文獻方法[5]，分別取刺梨果、刺梨根和刺梨葉樣品粉末各5.0 g，精密稱定，加入酸化的甲醇（含1.2 mol/L鹽酸） 50 mL，85 ℃回流8 h，再用旋轉蒸發儀濃縮至干，殘渣用二甲亞砜溶解并定容于100 mL量瓶中，作為母液。將刺梨果和刺梨根母液用流動相稀釋25倍，取刺梨葉母液用流動相稀釋50倍，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。（3）測游離鞣花酸供試品溶液的制備：參考文獻方法[5]，分別取刺梨果、刺梨根和刺梨葉粉末各5.0 g，精密稱定，加入90%甲醇溶液50 mL，室溫提取8 h，超聲處理（功率：300 W，頻率：45 kHz） 30 min，抽濾，再用旋轉蒸發儀濃縮至干，殘渣用二甲亞砜溶解并定容于100 mL量瓶中，作為母液。將刺梨果、刺梨根和刺梨葉的母液均用流動相稀釋25倍，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。
2.1.2 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：ACE Excel 2 C18-Amide（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，3%→6%B；5～10 min，6%→16%B；10～25 min，16%→21%B；25～35 min，21%→30%B）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；檢測波長：254 nm，進樣量：3 μL。精密吸取“2.1.1”項下制備的鞣花酸對照品溶液、測總鞣花酸的刺梨不同藥用部位的供試品溶液、測游離鞣花酸的刺梨不同藥用部位的供試品溶液以及陰性對照溶液（流動相），分別按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，在該色譜條件下，基線平穩，鞣花酸的峰形良好，陰性對照無干擾，鞣花酸峰與相鄰峰間的分離度>1.5，理論板數以鞣花酸峰計不低于4 000。超高效液相色譜圖見圖1。
2.1.3 線性關系考察 精密量取“2.1.1（1）”項下鞣花酸對照品溶液1.0、2.5、4.0、5.5、7.0、8.5、10.0 mL，分別置于20 mL量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，即得不同質量濃度的系列對照品溶液，分別按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，并以鞣花酸對照品的質量濃度為橫坐標（x， μg/m）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，并建立回歸方程。結果，得到鞣花酸的回歸方程為y=136.97x- 2 249.2（r=0.999 6），表明鞣花酸在19.96～199.60 μg/mL質量濃度范圍內與其峰面積線性關系良好。 2.1.4 精密度試驗 取“2.1.3”項下制備的質量濃度為20 μg/mL的鞣花酸對照品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，重復進樣6次，記錄峰面積。結果，鞣花酸峰面積的RSD=1.35%（n=6），表明儀器精密度良好。
2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.1（3）”項處理的測游離鞣花酸的刺梨果供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、8、12、24、48 h后，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，鞣花酸峰面積的RSD=0.97%（n=5），表明供試品溶在室溫條件下48 h內基本穩定。
2.1.6 重復性試驗 取刺梨果樣品粉末5.0 g，精密稱定，共6份，分別按“2.1.1（3）”項下方法制備測游離鞣花酸的供試品溶液，然后按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算鞣花酸含量。結果，鞣花酸含量的RSD=2.17%（n=6），表明此方法重復性良好。
2.1.7 加樣回收率試驗 精密稱定1 g已知含量的刺梨果樣品，分別按已知含量的80%、100%、120%加入鞣花酸對照品溶液，按“2.1.1（3）”方法制備測游離鞣花酸的供試品溶液，每個濃度制備3份樣品，然后按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算鞣花酸的加樣回收率。結果，鞣花酸的平均回收率為99.88%，RSD=1.43%（n=9）。結果見表1。
2.1.8 樣品含量測定 精密稱取刺梨果、刺梨根和刺梨葉樣品粉末適量，分別按“2.1.1（3）”項下方法制備含游離鞣花酸的供試品溶液和含總鞣花酸的供試品溶液，每個樣品平行制備3份，按“2.1.2”項下色譜條件進樣，記錄峰面積并計算各樣品中鞣花酸的含量。結果顯示，刺梨葉中游離鞣花酸含量和總鞣花酸含量均明顯高于刺梨果和刺梨根，其中以刺梨根樣品中游離鞣花酸和總鞣花酸含量最低；刺梨果和刺梨根中總鞣花酸含量約為相應部位游離鞣花酸含量的2倍，刺梨葉中總鞣花酸含量約為相應部位游離鞣花酸含量的5倍，測定結果見表2。
2.2 刺梨不同藥用部位醇提物的體外抗氧化活性測定
2.2.1 溶液的制備 （1）VC對照品溶液：精密稱取VC對照品適量，加入60%乙醇制成質量濃度分別為3、6、12、24、48、96 μg/mL的系列對照品溶液，作為DPPH自由基清除試驗的陽性對照。精密稱取VC對照品適量，加入70%乙醇制成10、20、40、80、160、320 μg/mL系列質量濃度的對照品溶液，作為ABTS自由基清除試驗的陽性對照。（2）DPPH標準溶液：精密稱定DPPH標準品適量，加入無水乙醇，制成濃度為1 mmol/L 的DPPH貯備液；用無水乙醇稀釋貯備液得到0.1 mmol/L的DPPH標準溶液，備用。（3）ABTS標準溶液：精密稱定ABTS標準品適量，加入70%乙醇制成濃度為7 mmol/L的標準溶液，備用。（4）供試品溶液：分別精密刺梨果、刺梨根和刺梨葉粉末各0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇溶液15 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率：300 W，頻率：45 kHz） 30 min，取出，放冷后再次稱定質量，用60%乙醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液減壓濃縮至干，得到刺梨果、刺梨根和刺梨葉提取物，得率分別為40.4%、14.0%和26.4%。將各提取物分別用60%乙醇溶解并稀釋為3、6、12、24、48、96 μg/mL系列質量濃度的供試品溶液，用于DPPH自由基清除試驗；將各提取物分別用60%乙醇溶解并稀釋為10、20、40、80、160、320 μg/mL系列質量濃度的供試品溶液，用于ABTS自由基清除試驗。
2.2.2 DPPH自由基清除試驗 參考文獻方法[6]，分別取0.1 mmol/L DPPH標準溶液4.0 mL與不同質量濃度的供試品溶液/VC對照品溶液2.0 mL，振蕩混勻，將溶液于暗處靜置 30 min 后，在517 nm波長下測定其吸光度。按照公式計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率（%）=（A0-AX+AX0）/A0×100%，式中：AX為2.0 mL供試品溶液/VC對照品溶液與DPPH標準溶液反應后的吸光度；AX0 為2.0 mL供試品溶液/VC對照品溶液+4.0 mL無水乙醇的吸光度；A0為4.0 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH標準溶液+2.0 mL 60%乙醇的吸光度。并以純凈水為空白進行調零。每個樣品重復測定3次，取平均值。采用GraphPad Prism 6.0 軟件計算各樣品對DPPH自由基的半數清除濃度（IC50），數據均以x±s表示，并采用t檢驗進行組間兩兩比較，P<0.05表示差異有統計學意義。結果表明，刺梨不同藥用部位醇提物對DPPH自由基清除能力的強弱排序為刺梨葉>刺梨果>刺梨根。其中，刺梨葉和刺梨果對DPPH自由基清除能力與VC相當，IC50差異無統計學意義（P>0.05）。刺梨3個藥用部位醇提物對DPPH自由基清除活性大小的測定結果見表3。
2.2.3 ABTS自由基清除試驗 參考文獻方法[6]，取“2.2.1（3）”項下濃度為7 mmol/L的ABTS標準溶液5.0 mL，加入濃度為140 mmol/L的過硫酸鉀88.0 ?L，在室溫下暗處反應 12～16 h，然后在734 nm波長處，用70%乙醇將ABTS標準溶液稀釋至吸光度為（0.70±0.02），備用。準確移取“2.2.1（1）”項下系列質量濃度VC對照品溶液或供試品溶液0.1 mL，分別加入上述稀釋后的ABTS標準溶液3.9 mL，混勻，在室溫下反應6 min，于734 nm波長處測定其吸光度（AE）；同時準確移取ABTS標準溶液3.9 mL，加入70%乙醇溶液0.1 mL，于734 nm波長處測定其吸光度（AB），并按公式計算ABTS自由基清除率： ABTS自由基清除率（%）=（AB-AE）/AB×100%。并以純凈水為空白進行調零。每個樣品重復3次，取平均值，按“2.2.2”項下方法計算IC50并進行組間統計分析。結果表明，刺梨不同藥用部位醇提物對ABTS自由基清除能力的強弱排序為刺梨葉>刺梨果>刺梨根。其中，刺梨葉和刺梨果對ABTS自由基清除能力與VC相當，IC50差異無統計學意義（P>0.05）。刺梨3個藥用部位醇提物對ABTS自由基清除活性大小的測定結果見表3。 3 討論
《藥食同源民族藥——刺梨》對現有文獻報道的刺梨中的化學成分含量測定方法進行了總結，歸納了文獻中維生素、黃酮、超氧化物岐化酶、氨基酸、多糖等成分的含量測定方法[9]，但尚未發現刺梨中鞣花酸含量測定的相關報道。石榴皮是鞣花酸的主要原料來源之一，目前已經有多項專利報道了從石榴皮中提取鞣花酸的方法[10-12]。本研究在建立良好色譜條件的基礎上對刺梨果、刺梨根和刺梨葉中鞣花酸含量進行了分析。結果表明，刺梨葉中鞣花酸含量明顯高于刺梨根和刺梨果。且文獻報道的石榴皮中游離鞣花酸含量約為32 mg/g[13]，而刺梨葉中游離鞣花酸含量（約為39 mg/g），略高于石榴皮。另據文獻報道，鞣花酸與鞣花酸的多種糖苷共同存在于刺梨中[6]，藥材中的鞣花酸糖苷經強酸和高溫共同作用后會使糖苷鍵斷裂，該過程可將鞣花酸糖苷轉化成鞣花酸。因此，藥材經酸水解后，以鞣花酸作為對照即可測定其總量。
DPPH自由基和ABTS自由基清除試驗作為經典的體外抗氧化活性測定方法，廣泛應用于中藥材的抗氧化活性評價中[14-15]。本研究通過DPPH自由基和ABTS自由基清除試驗，比較了刺梨不同藥用部位醇提物的體外抗氧化作用。發現在DPPH自由基和ABTS自由基清除試驗中，刺梨不同藥用部位的抗氧化活性強弱順序均為刺梨葉>刺梨果>刺梨根，并且刺梨果和刺梨葉的IC50與陽性對照VC相當。
UPLC含量測定結果顯示，刺梨不同藥用部位中游離鞣花酸含量高低順序為刺梨葉（38.66 mg/g）>刺梨果（20.73 mg/g）>刺梨根（11.36 mg/g），且經酸水解后的總鞣花酸含量的高低順序也同樣為刺梨葉（197.94 mg/g）>刺梨果（48.86 mg/g）>刺梨根（21.85 mg/g）?？梢?，刺梨不同藥用部位經酸水解后的鞣花酸（總鞣花酸）含量得到了顯著增加，這表明刺梨不同藥用部位的鞣花酸糖苷類成分或鞣花酸單寧的含量較高。
結合體外抗氧化活性試驗結果和鞣花酸（包括游離鞣花酸與總鞣花酸）含量測定結果分析，發現刺梨葉的鞣花酸含量最高，抗氧化活性最強。并且不同部位的鞣花酸含量越高，對應的抗氧化活性也越強。鞣花酸作為多酚類成分具有良好的抗氧化活性，故推測刺梨不同藥用部位抗氧化活性的強弱與其多酚類含量的高低可能有著密切的聯系，但尚需進一步驗證。本研究結果對綜合開發利用刺梨資源提供了一定的實踐指導意義。
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