煙草不同葉位多酚含量及相關酶活性變化的研究

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　　摘要：為分析煙葉在生長過程中的次生代謝物質動態變化特征、相關酶的活性變化規律，以3個烤煙種植試驗點的烤煙為研究對象，研究不同葉位煙草葉片多酚類物質含量、抗氧化活性和表達量。結果表明，同一個采樣點中，不同葉位煙葉多酚類物質含量表現為上葉位>中葉位>下葉位。不同葉位煙草葉片PAL、PPO、C4H和4CL活性以上葉位最高。通過多酚體外抗氧化測定，表明不同葉位多酚對DPPH和羥基自由基有一定的清除能力。熒光定量PCR檢測發現，PAL基因和PPO基因在上葉位中的表達顯著高于其他葉位?？緹熒L過程中的次生代謝物質動態變化，相關酶的活性變化及基因表達水平與煙葉成熟度存在一定的關聯。
　　關鍵詞：煙草;不同葉位;多酚;酶活性;抗氧化活性
　　中圖分類號：S572         文獻標識碼：A
　　文章編號：0439-8114（2019）09-0080-06
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.018           開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
　　Abstract： Aiming to analyze the dynamic changes of secondary metabolites and related enzymes during tobacco growth， the content， antioxidant activity and expression level of polyphenols in tobacco leaves at different leaf positions were studied in three tobacco planting experimental sites. In the same sampling site， the content of polyphenols in tobacco leaves of different leaf positions showed as follows：upper leaf position>middle leaf position>lower leaf position. The activities of PAL， PPO， C4H and 4CL in tobacco leaves at different positions showed that the enzyme activity in the upper leaves was the highest. The antioxidant activity of polyphenols in vitro showed that polyphenols in different leaf positions had certain scavenging ability to DPPH and hydroxyl free radicals. q-PCR analysis showed that the expression of PAL and PPO genes in the upper leaf was significantly higher than that of other leaf positions. Dynamic changes of secondary metabolites， enzyme activity and gene expression levels were correlated with tobacco maturity during the growth of flue-cured tobacco.
　　Key words： tobacco; different leaf positions; polyphenols; enzyme activity; antioxidant activity
　　煙草體內的糖類、脂類和蛋白質經過代謝后產生了酚類化合物，存在于煙草葉片和煙氣中，在其生長和發育、香氣味產生、產品調制、煙葉顏色和光澤等方面起著重要的作用[1，2]。煙草葉片的多酚類物質主要包含蕓香苷、綠原酸和莨菪亭，其中含量較高的綠原酸和蕓香苷占煙葉總酚化合物含量的75%～95%[3]。
　　多酚類物質是由芳香族氨基酸脫氨經由肉桂酸和香豆素形成的，它是植物體中苯丙烷代謝途徑重要的代謝產物，多酚類物質含量與煙草品質形成有著緊密的聯系，研究表明多酚類物質可提高煙草植株在逆境脅迫中抗逆能力和抗氧化水平[4-6]。Zucker等[7]研究表明多酚化合物在煙草植株的不同部位含量不同，葉中累積量較大，莖和根中累積量少。成熟煙株不同葉位的多酚含量從上部葉到下部葉逐漸降低，其中上部葉綠原酸含量最高，達到4.22%，下部葉綠原酸含量為3.14%，達到最低值[8]。
　　烤煙次生代謝在生態條件差異下，對煙草的內在物質含量及積累都有重要影響。在不同生態條件下，煙葉的內在質量相差很大，不同地區、不同品種其品質相差很大，煙葉多酚不僅是衡量煙葉質量的一個重要因子，與煙草植株的生長及煙葉發育、抗逆性都有著相關性，影響煙葉多酚合成的因素包括煙葉部位、成熟度以及水分、溫度、濕度、日照、栽培措施等因子。研究發現煙株內多酚類物質可以在不同部位間轉移，綠原酸的合成可以在煙草葉片和莖中進行，但根中不能合成，在開花時期的光周期誘導作用下，綠原酸在成熟植株中從上部轉移到根部[9]。多酚類化合物含量與煙葉等級相一致，等級高的煙葉多酚含量較高[10]，等級較好的煙葉中綠原酸和蕓香苷的含量也較高[2]，低等級煙葉的多酚含量低[10]。
　　酚類化合物在煙草生長發育過程中，其生成過程和累積過程與相關酶類，包括多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）等生理活性有著緊密的聯系[11]。PPO是一種含有Cu2+的結構蛋白，能進行多酚類物質上的羥基的催化，使之發生氧化反應并轉化為醌，細胞內的氨基酸與醌能發生聚合反應形成色素產生沉淀[11]。前人的研究工作主要關注煙草調制過程中煙葉中多酚化合物及其相關酶的活性研究，但針對整個煙株生長發育過程尚缺乏多酚類物質的含量及其相關酶活性變化的關聯性研究分析。 　　本研究以云南省昆明3個烤煙種植試驗點的烤煙為研究對象，研究品種與不同葉位間多酚類物質積累的差異，探討提高煙葉品質的最適效應?？疾觳煌~位煙草葉片多酚類物質含量，分析其抗氧化活性和表達量，以期為煙草種植、煙葉生產管理及煙葉品質提高提供參考。進一步掌握次生代謝產物對煙葉的品質影響，為合理調控煙葉的發育進程提供理論依據與技術支撐。
　　1  材料與方法
　　1.1  試驗材料
　　以云南省昆明烤煙為研究對象，分別選取宜良縣和石林縣的3個烤煙種植試驗點，供試材料品種為紅花大金元（宜良縣）和K326（石林縣）。采摘成熟期煙草葉片，根據葉片（上部葉片完全展開，下部葉片不失綠）在莖稈上的著生位置，從上到下依次為上、中、下葉位。采樣具體信息見表1。
　　1.2  試驗方法
　　1.2.1  多酚類物質含量測定  取樣后干燥煙草葉片，粉碎后過80目篩。稱取4 g煙草樣品在提取溫度75 ℃、乙醇濃度（V/V）50%、液料比20 mL/g提取條件下回流提取50 min，提取完畢后趁熱過濾，待濾液冷卻至室溫后用提取溶劑定容至100 mL，得煙草多酚提取液。
　　根據Folin-Ciocalte法，繪制沒食子酸標準曲線，在540 nm波長下測定樣品的吸光度，計算煙草提取液中多酚提取率。煙草多酚提取液中多酚濃度可由沒食子酸標準曲線的回歸方程計算得出，并按照公式得出煙草多酚提取率。
　　式中，C為多酚濃度（mg/mL）;Va為容量瓶量程（100 mL）;Vb為提取液總體積（100 mL）;M為樣品質量（4 g）;V為取液量（10 mL）。
　　1.2.2  酶活性測定  采用紫外分光光度法利用 PAL活性測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性，肉桂酸-4-羥化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）活性參照Kong等[12]的方法測定。
　　1.2.3  抗氧化活性測定
　　1）不同濃度提取液的配制。將煙草多酚提取液稀釋成多酚濃度梯度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL的溶液。配制濃度梯度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL的維生素C溶液。
　　2）測定DPPH清除率。DPPH無水乙醇溶液為紫色，被還原時退色，且退色程度與清除率呈正比，在517 nm處有特征吸收。以維生素C為對照，測定煙草不同葉位多酚對DPPH的清除能力。
　　根據李西柳等[13]的方法測定。測定清除DPPH的能力，先配制0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液于棕色瓶中并于0～4 ℃保存。分別準確量取上述溶液2 mL于試管中，再加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，室溫下反應30 min;將DPPH無水乙醇溶液和煙草多酚溶液用等濃度乙醇置換，重復上述步驟，在517 nm處測定吸光度X1、X2和X0。重復兩次取平均值，根據公式計算：
　　3）測定羥基自由基清除率。生物體內活性最強的氧自由基是羥基自由基，所以評價抗氧化活性的重要指標之一就是清除羥基自由基的能力。以維生素C為對照，測定煙草不同葉位多酚對羥基自由基的清除能力。
　　根據吳林秀等[14]的方法測定。采用的水楊酸鈉絡合法測定，先分別準確量取上述溶液2 mL于試管中，再加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L H2O2各2 mL于試管室溫下反應20 min。然后分別加入9 mmol/L水楊酸鈉溶液2 mL室溫下反應20 min。將水楊酸鈉溶液和煙草多酚溶液用等量蒸餾水置換，重復上述步驟，在510 nm處測定吸光度X1、X2和X0。重復兩次取平均值，根據公式計算：
　　4）引物設計及表達量測定。對各處理樣品的cDNA模板進行PAL基因表達量的測定。RT-qPCR體系按照SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）操作指南進行。熒光定量使用Master cycler ep realplex 2S（Eppendorf）。使用Real Time PCR熒光定量儀進行相對實時熒光定量PCR。擴增反應體系為20 μL∶10 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，5 μL（50 ng/L） cDNA 模板，正、反引物各1 μL，3 μL ddH2O。反應條件為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環，72 ℃單點檢測信號。以煙草Actin作為內參基因，每個樣品RT-qPCR采用3 次重復，運用2-ΔΔCT算法分析各基因的表達量。
　　根據qRT-PCR引物設計的要求，采用Primer 5.0軟件進行引物設計（表2）。以Actin為內參基因，采用2-ΔΔCT法進行基因相對定量分析。
　　1.3  數據處理
　　采用SPSS 19.0軟件進行LSD多重比較法方差分析，Excel和Origin 9.1軟件制作圖表。
　　2  結果與分析
　　2.1  不同葉位煙葉的多酚提取率
　　從圖1可以看出，宜良縣3個采樣點的9個樣品，不同葉位煙草葉片多酚提取率存在著明顯差異，其中1號采樣點的3號樣（上葉位）的多酚提取率最高，是同個采樣點的中葉位和下葉位提取率的1.29和1.78倍。
　　從圖2可以看出，石林縣3個采樣點的9個樣品，不同葉位煙草葉片多酚提取率存在著明顯差異，其中3號采樣點的18號樣（上葉位）的多酚提取率最高，是同個采樣點的中葉位和下葉位提取率的1.61和1.67倍。 　　2.2  不同葉位煙草葉片PAL、PPO、C4H和4CL活性分析
　　由圖3可知，不同葉位煙草葉片PAL活性隨著葉位的不同呈現不同的趨勢，其中宜良縣和石林縣所有采樣點上葉位PAL活性均大于中葉位和下葉位。宜良縣3號采樣點的9號樣和石林縣3號采樣點的18號樣PAL活性明顯高于其他葉位。
　　由圖4可知，不同葉位煙草葉片PPO活性隨著葉位的不同呈現不同的趨勢，其中宜良縣和石林縣所有采樣點上葉位PPO活性均大于中葉位和下葉位。宜良縣3號采樣點的9號樣和石林縣3號采樣點的18號樣PAL活性明顯高于其他葉位。
　　由圖5可知，不同葉位煙草葉片C4H活性隨著葉位的不同呈現不同的趨勢，其中宜良縣和石林縣所有采樣點上葉位C4H活性均大于中葉位和下葉位。宜良縣3號采樣點的9號樣和石林縣3號采樣點的18號樣C4H活性明顯高于其他葉位。
　　由圖6可知，不同葉位煙草葉片4CL活性隨著葉位的不同呈現不同的趨勢，其中宜良縣和石林縣所有采樣點上葉位4CL活性均大于中葉位和下葉位。宜良縣的3號樣和9號樣及石林縣的12號樣和18號樣4CL活性明顯高于其他葉位。
　　2.3  不同葉位煙葉多酚體外抗氧化結果
　　2.3.1  清除DPPH結果與分析  由表3可知，隨著不同葉位煙葉多酚提取液和維生素C濃度的增加，對DPPH的清除率也在逐漸增大，呈現出濃度依賴性。經計算煙葉多酚提取液的IC50為0.0019 mg/mL。當18號樣品濃度到達0.006 mg/mL時，其清除率可達到80.94%，當濃度到達0.005 mg/mL以后，對DPPH的清除率趨于穩定;而維生素C的IC50為0.000 6 mg/mL，IC50越小表示其抗氧化能力越強，說明不同葉位煙葉多酚對DPPH有一定的清除能力，但清除能力較維生素C稍弱。
　　2.3.2  清除羥基自由基結果與分析  由表4可知，隨著煙草葉片多酚提取液和維生素C濃度的增加，對羥基自由基的清除率也在逐漸增大，呈現出濃度依賴性。經計算煙葉多酚提取液的IC50為0.003 7 mg/mL。當18號樣品濃度到達0.006 mg/mL時，其清除率可達78.67%，當濃度到達0.005 mg/mL以后，對羥基自由基的清除率趨于穩定;而維生素C的IC50為0.000 6 mg/mL，IC50越小表示其抗氧化能力越強，說明不同葉位煙葉多酚對羥基自由基有一定的清除能力，但清除能力較維生素C稍弱。
　　2.4  不同葉位煙葉PAL和PPO基因表達分析
　　熒光定量PCR檢測發現，PAL基因主要在上部葉中的表達量最高，其次是在中部葉，下部葉中的表達量最低（圖7）。隨著葉位的不同呈現不同的表達趨勢。其中，宜良縣采樣點的3號樣、9號樣和石林縣的18號樣PAL基因表達顯著高于其他葉位。PPO基因均在上部葉中的表達量最高，表達量最低的葉位是下葉位（圖8），宜良縣采樣點的3號樣、6號樣和9號樣與石林縣采樣點的12號樣、15號樣和18號樣PPO基因在上葉位中的表達明顯高于其他葉位。
　　3  小結與討論
　　成熟度是決定煙草品質的一個主要因素，研究表明由于成熟度差異煙葉中內含物累積的不同，影響著原煙產品質量和品質，成熟度不同的煙葉，其多酚化合物含量有明顯的差異[15，16]。王丹等[17]研究了2個烤煙品種在不同成熟期多酚化合物及氧化酶活性的變化，結果發現隨著煙葉的成熟，葉片中的多酚和抗壞血酸的含量逐漸升高，多酚氧化酶和過氧化物酶活性在適熟時達到最高。
　　由于不同地區的環境影響因素不同，使在不同地區種植同一煙草品種時，會存在生長狀態和內部化學成分含量差異的情況。煙葉在發育過程中，其多酚化合物含量隨著煙葉的成熟度變化，煙葉過熟時多酚化合物含量呈現下降趨勢。本研究結果表明，不同葉位煙葉多酚類物質含量呈現出上葉位較高趨勢，中葉位次之，下葉位葉片的多酚類物質含量最低。通過測定不同葉位煙草葉片PAL、PPO、C4H和4CL活性，結果表明上葉位、中葉位和下葉位煙草葉片的酶活性隨著葉位的不同呈現出不同的趨勢。相關研究表明，青黃葉、大葉黃和大白花3個品種中，苯丙氨酸解氨酶活性與綠原酸和蕓香苷的變化規律相同，多酚氧化酶活性和過氧化物酶活性呈單峰趨勢。孟莉等[18]的研究發現多酚氧化酶活性在煙葉生長過程中和總酚的含量呈現出負相關趨勢，過氧化物酶活性與總酚的含量呈現出正相關趨勢。袁衛瑜等[19]發現打頂后能提高煙葉多酚類物質的含量，煙葉成熟度增加后，中部葉的多酚總量提高，而上部葉多酚總量下降，同時還發現中部葉和上部葉的PAL活性與其他酚類物質含量均呈正相關，PPO活性與酚類物質含量均呈負相關。打頂誘導煙葉多酚生物合成與生育期有關，楊銀菊等[20]發現苗期打頂后，煙葉中多酚含量降低，而現蕾后打頂煙葉中多酚含量升高。
　　在煙草生長過程中，多酚是植物中重要的次生代謝產物和生物活性物質，煙葉中多酚含量的變化與煙株生長狀態密切相關，其中光是影響植物多酚含量的重要非生物因素，從煙草K326中分離到光敏色素B同系物NTFYB1，分析了其光受體在煙草多酚代謝調控中的作用，結果表明NtPHYB1參與煙草葉片多酚代謝的調節，其表達有利于綠原酸及其異構體的積累，同時NtPHYB1可調節PAL4、4CL1和COMT基因的轉錄[21]。
　　同一個采樣點中，不同葉位煙葉多酚類物質含量表現為上葉位>中葉位>下葉位。不同葉位煙草葉片PAL、PPO、C4H和4CL活性結果表明，上葉位的酶活性最高。通過多酚體外抗氧化測定，表明不同葉位多酚對DPPH和羥基自由有一定的清除能力。熒光定量PCR檢測發現，PAL基因和PPO基因在上葉位的表達明顯高于其他葉位。
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　　收稿日期：2018-09-30
　　基金項目：中國煙草總公司云南省公司重點資助項目“基于品牌導向的煙葉定向需求技術研究與應用”（2017YN12）
　　作者簡介：李曉寧（1981-），女，山西大同人，講師，碩士，主要從事土壤化學的研究工作，（電話）0871-65227651（電子信箱）14576221@qq.com;通信作者，趙  艷（1982-），女，高級實驗師，博士，主要從事生物化學的研究工作，（電話）0871-65220462（電子信箱）zhaoyankm@126.com。
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