多糖含量測定的方法綜述
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摘 要：多糖是生命科學中不可缺少的生物大分子，具有復雜、多方面的生物活性和功能，但由于其分子量大、結構復雜，而且缺少易于檢測的發光基團，成為困擾人們對多糖進行進一步研究的一個大問題?，F結合近年文獻，對多糖的含量測定進行綜述。
關鍵詞：多糖;含量測定;綜述
Abstract：Polysaccharides are indispensable biological macromolecules in life science， which have complex and multifaceted biological activities and functions. It has been a problem with the research of polysaccharides because of its intricate structur. In conjunction with recent literature， a review of polysaccharides has been determined.
Key words：Polysaccharides; Content determination; Review
中圖分類號：Q53
多糖（polysacharides，PS）是由糖苷鍵結合的糖鏈，至少要超過10個的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式（C6H10O5）n表示。多糖在自然界分布極廣，亦很重要：有的是構成動植物細胞壁的組成成分，如肽聚糖和纖維素;有的是作為動植物儲藏的養分，如糖原和淀粉;有的具有特殊的生物活性，如人體中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌細胞壁中的多糖有抗原作用。多糖的結構單位是單糖，多糖相對分子質量從幾萬到幾千萬。多糖在自然界高等植物、藻類、微生物（細菌和真菌）與動物體內均普遍存在。
近年來，多糖的應用更加廣泛。多糖因有著多種多樣的生物學功能，成為了近年來的一大研究熱點。多糖類物質具有復雜多樣的生物活性和功能：多糖具有免疫調節功能[1]，它能減少通常使用的免疫抑制劑的諸如細胞毒性、機體抗感染能力下降;還可以降低致病菌的繁殖速度[2-3];有些可以治療慢性病毒性肝炎、癌癥等免疫系統疾病，甚至有著抗AIDS病毒的功能[4]，有著抗感染、降血糖、降血脂、促進核酸與蛋白質的生物合成、抗放射、抗凝血的作用[5]，能控制細胞分裂和分化，調節細胞的生長與衰老[6]等。
多糖類物質的生物活性對人類的生命健康來說都具有極其高的價值。隨著生活水平的提高和人口老齡化時代的到來，人類將更加關注保健與養生，而多糖類的廣泛性與顯著的生物學活性，正好契合這種需要。而且研究發現，多糖對人體無毒副作用，這一點特別受到世界醫學科學研究者的厚愛，被譽為21世紀的人類醫學保健領域的救星。因而多糖的研究已經成為了一大熱點，多糖多樣的生物活性與其復雜的結構息息相關，但是目前在多糖的結構和含量分析這一領域的研究還相對緩慢，多糖的結構復雜，因此在對其進行檢測時就需要選用合適的方法。本文介紹了多糖含量測定的幾種常用方法，各種方法都其優缺點，因此在選擇時還需要根據實際情況具體分析應用。
1 比色法
1.1 硫酸-咔唑比色法
硫酸-咔唑比色法是一種常見的被廣泛應用于糖醛酸測定的方法，其原理是多糖經水解生成半乳糖醛酸，在硫酸中與咔唑試劑發生縮合反應，生成紫紅色化合物，其呈色強度與半乳糖醛酸含量成正比，可比色定量。如郭欣等人[7]在研究中對酸性多糖中的葡萄糖醛酸（GA）與中性糖的含量進行測定。果膠（Pectin）是一組聚半乳糖醛酸，其主要成分是部分甲酯化的α-1，4-D-聚半乳糖醛酸，因此可用硫酸咔唑法測定果膠多糖的含量。此法簡單、快速、靈敏、重復性好，對每種糖僅制作一條標準曲線，顏色持久。如陶阿麗等[8]在實驗中使用咔唑硫酸比色法測定皖南山區豆腐柴葉中果膠的含量。本法操作簡單、穩定性好，用于實際樣品測定時效果較為滿意。
1.2 苯酚硫酸比色法
苯酚濃硫酸法是一種簡單快速測定多糖含量的方法，在各類研究中被廣泛應用。苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，在約
490 nm處測定光吸收值，進而對樣品定量。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，并且產生的顏色穩定160 min以上。尤獻民等[9]應用該法對不同產地老頭草中的多糖含量進行了測定，牛麗麗[10]在研究分析中測定了中國市場上淫羊藿中的多糖含量。
1.3 蒽酮-硫酸法比色法
蒽酮比色法是一種快速而簡便的定量方法。蒽酮可以與游離的己糖或多糖中的己糖基、戊糖基及己糖醛酸起反應，反應后溶液呈藍綠色，在620 nm處有最大吸收。本法多用于測定糖原的含量，也可用于測定葡萄糖的含量。在應用此法進行分析時，注意蒽酮要避光保存。配制好的蒽酮試劑也應注意避光，當天配制好的當天使用。而且注意溫度要控制在100 ℃，從100 ℃開始準確計時10 min，然后迅速冷卻，于室溫中平衡10 min，加熱、比色時間應嚴格掌握。馬昌豪
等[11]采用硫酸-蒽酮比色法測定玫瑰花可溶性多糖和粗多糖的含量，對不同品種玫瑰花進行多糖含量的差異的研究。該方法操作簡單，顯色也非常靈敏。崔宏春[12]用蒽酮比色法測定綠茶水溶性多糖的含量。由此可見，該法在研究中被廣泛應用。
1.4 間羥基聯苯比色法
間羥基聯苯比色法可對糖醛酸進行測定。多聚己糖醛酸與含四硼酸鈉的硫酸溶液在高溫作用下水解，水解產物進一步與間羥基聯苯反應，生成粉紅色衍生物，產生紫外吸收，且在一定濃度范圍內，該衍生物吸收值與糖醛酸含量呈線性關系，可通過比色法對糖醛酸含量進行計算。間羥基聯苯法是糖醛酸含量測定中比較成熟的方法。間羥基聯苯法操作簡便靈敏，樣品穩定性、重現性較好，回收率高。俞丹等[13]人用該方法對多糖中糖醛酸含量進行測定。 1.5 3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法
利用堿性條件下，二硝基水楊酸（DNS）與還原糖發生氧化還原反應，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內顏色深淺與還原糖含量成比例關系的原理，用比色法測定還原糖含量的。因其顯色的深淺只與糖類游離出還原基團的數量有關，而對還原糖的種類沒有選擇性，故DNS方法適合用在多糖（如纖維素、半纖維素和淀粉等）水解產生的多種還原糖體系中。張向萍等[14]采用該法對玉竹滴丸中單糖進行含量測定。經DNS試劑顯色后，于540 nm處測定吸光度，在此波長處溶液的吸光度與葡萄糖含量呈良好的線性關系。該方法簡單易行，重復性好，可作為玉竹滴丸質量控制標準。朱志川等[15]對黨參均一多糖CPS-a的含量測定中采用此法測定多糖CPS-a含量，該法簡便、快速，測定結果準確可靠。
2 色譜法
2.1 氣相色譜法（GC）
將多糖酸水解或甲醇醇解，用衍生物法以增加其揮發性，采用氣相色譜分析法可測定其含量。劉源才等[16]用氣相色譜法分析了枸杞多糖的含量，將枸杞多糖進行水解衍生化處理后用氣相色譜法和高效液相色譜法測定單糖組成及多糖含量。Zenaida Guadalupe[17]文中介紹用氣相色譜-質譜的方法，確定單個葡萄酒多糖的精細化學結構，而且可以估計葡萄酒中多糖的總體組成?？梢娫摲ú僮骱唵?、結果準確，因而被廣泛應用。
2.2 液相色譜法（HPLC）
高效液相色譜法是20世紀60年代后期發展起來的一種分析方法，近年來也被廣泛用于多糖的測定方面，可對單糖和寡糖進行常量和微量分析。如王剛等[18]對山藥多糖的提取分離及山藥總多糖的含量測定研究中，利用HPLC法測定山藥總多糖，結果較準確。薛俊
杰[19]應用HPLC法甘露醇與其他單糖或糖醇有效分離，方法學研究發現，該法重復性好、精密度高和重現性好，且加樣回收率在95%～105%，適合于北蟲草中甘露醇的測定。由于糖類不具有紫外吸收和熒光吸收，可以對其進行衍生化處理，提高檢測靈敏度。如Wenjing Zhang[20]研究中建立了一種快速、靈敏、重現性好、柱后熒光衍生化的高效液相色譜法測定體內低分子量硫酸多糖的含量，王佩香[21]采用該法進行了桑枝多糖的初步研究。由此可見，高效液相色譜法在多糖方面的研究應用十分廣泛。
3 紅外光譜定量分析多糖法
紅外光譜定量分析是借助于對比吸收峰強度來進行的，只要混合物中的各組分能有一個特征的，不受其他組分干擾的吸收峰存在即可。原則上，液體、圓體和氣體樣品都能應用紅外光譜法作定量分析。紅外定量分析的原理和可見紫外光譜的定量分析一樣，也是基于比耳-朗勃特（Beer-Lambert）定律。紅外光譜定量方法主要有測定譜帶強度和測量譜帶面積兩種。此外也有采用譜帶的一階導數和二階導數的計算方法，這種方法能準確地測量重疊的譜帶，甚至包括強峰斜坡上的肩峰。該法具有快速、簡單，可以對多糖進行快速分析的優點。任紹剛[22]對云芝的含量測定研究了采用偏最小二乘法（PLS）建立云芝菌絲體干粉樣品的近紅外漫反射光譜與其中多糖和蛋白含量間相關模型。分別采用Savitzky-Golay平滑法、快速傅立葉變換（FFT）、一階導數光譜法和二階導數光譜法對所有樣品的近紅外漫反射光譜進行預處理，應用預處理后的光譜在不同的光譜區域分別建立定量分析模型。該分析結果表明該方法結果準確可靠，重現性、穩定性均良好，有望應用于大批量產品的快速、在線檢測。
4 紫外分光光度法
紫外-可見分光光度法是根據物質分子對波長為200～760 nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結構分析方法，操作簡單、準確度高、重現性好。李孝棟等[23]采用紫外分光光度法測定黃芪中多糖的含量，通過對多糖部位的水溶部分、水不溶部分及兩部分混合物的多糖含量測定，表明水溶部分與水不溶部分總多糖的含量和兩部分混合物的多糖含量近乎相同。其主要特點為靈敏度高，可達
10-4～10-7 g·mL-1;準確度高，相對誤差為2%～5%。中藥中有紫外吸收的成分或本身有顏色的成分，在一定的濃度范圍內，其溶液的吸收度與濃度符合朗伯-比
爾定律，均可用此法進行分析。衛強等[24]研究提取菊葉中多糖的工藝，并建立菊葉中多糖的含量測定方法。以紫外可見分光光度法檢測多糖含量，該法測定方法穩定、操作簡單，靈敏度和準確度高。如張由芹等[25]在對發酵天龍粉多糖的含量測定采時用紫外分光光度法，操作過程簡單，準確度高，誤差小。
5 一些新的研究方法
5.1 共振光散射（RLS）法
成芳[26]在研究南方紅豆杉含量中探究了一種新的對多糖含量進行測定的方法——共振光散射（RLS）法。研究表明：波長460.0 nm，NaOH濃度1.0 mol·L-1，CPC濃度1.0 mmol·L-1，與多糖反應10 min，RLS強度最大。在2.4～12 μg·mL-1范圍內，RLS強度與多糖對照品濃度成線性關系。
5.2 生物傳感器法
生物傳感器（Biosensor）是一種對生物物質敏感并將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器，是由固定化的生物敏感材料作識別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質）、適當的理化換能器（如氧電極、光敏管、場效應管、壓電晶體等等）及信號放大裝置構成的分析工具或系統。利用酶的專一性反應，能實現多糖的測定和含量分析。作為多糖測定的一種較新的研究方法，該法近年來也成為關注的焦點。
此外，氧化還原滴定法也可用于多糖的含量測定。但是水樣中的還原性物質對糖的測定會造成影響，過程較為復雜，誤差大。
6 結語
以上介紹了多糖含量測定的一些方法，不同的方法測定的特定多糖也不相同。因此在選擇多糖分析方法時，要通過分析對比，以選擇最方便簡單的方法進行研究。 在多糖的測定中，比色法一般應用較為廣泛。最為常見的有苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法，具有靈敏度高，結果較為準確的優點。但這兩種方法也有一定的缺點，如實驗操作較復雜，步驟多且繁瑣，而且只可以測定多糖總體的含量，而不能測得含有單糖的部分物質，如果含有單糖，實驗結果會有極大的誤差。蒽酮-硫酸法比色法操作雖然簡單，但是蒽酮試劑需要現用現配，而且需要嚴格控制實驗操作的溫度。而且在測定水溶性碳水化合物時，則應注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應液中，否則會因為細胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發生反應而增加測定誤差。二硝基水楊酸法操作簡便、快速、靈敏度高，在多糖含量的測定中常被應用。光譜法具有操作簡單，準確度和靈敏度都相對比較高的優點，因此可以在研究中廣泛應用。
另外，除了一些常見的對多糖含量進行分析的方法，還研究出了很多新方法用于多糖的含量測定，在測定時也同樣被廣泛應用。多糖因為其分子質量大，結構較為復雜，所以目前對多糖的研究進展還很緩慢。我國的多糖資源十分豐富，具有很大的研究和開發前景，而且多糖類藥物在治療腫瘤、抗病毒、降血糖等方面的貢獻也越來越大，已成為天然藥物及保健品研發中的重要組成部分。同時也應看到，無論是國內還是國外，多糖的研究與蛋白質和核酸的研究相比還有相當的差距。所以開展各種植物多糖分離純化及含量測定方法研究，既有理論意義，也有現實意義。此外，多糖分析還有其他一些方法，隨著檢測儀器不斷革新升級，多糖含量檢測方法趨于多樣化。多糖含量檢測總的發展趨勢是使檢測過程更簡便、快速、準確、實現痕量檢測、在線檢測及更多反映結構信息等。
參考文獻：
[1]彭臻菲.兩性葡聚糖免疫應答與免疫調節機制研究[D].福州：福州大學，2006.
[2]彭愛銘，佟建明，崔建云，等.地衣芽孢桿菌TS-01胞外多糖功能的研究[J].食品科學，2004，25（S1）：158-162.
[3]Mao W，Li Y，Wu L，et al. Chemical characteriz-ation and radioprotective effect of polysaccharide from Monostroma angicava （Chlorophyta）[J]. Journal of Applied Phycology，2005，17（4）：349-354.
[4]常 晨，包怡紅.樺褐孔菌多糖的研究進展[J].食品與機械，2017，33（1）：201-204.
[5]馮艷風.大棗多糖體外抗凝血活性研究[D].鄭州：河南農業大學，2013.
[6]王 力.淫羊藿總多糖對體外培養SD大鼠骨髓間充質干細胞生長影響的研究[D].成都：成都中醫藥大學，2009.
[7]郭 欣，高向東，楊曉兵.酸性多糖中的葡萄糖醛酸與中性糖的含量測定[J].中國生化藥物雜志，2004，25（2）：100-101.
[8]陶阿麗，張國升.咔唑硫酸比色法測定皖南山區豆腐柴葉中果膠含量的研究[J].赤峰學校學報（自然科學版），2012（21）：108-110.
[9]尤獻民，金 薇，鄒桂新，等.老頭草中多糖的含量測定[J].時珍國藥研究，1997（6）：156-158.
[10]牛麗麗.淫羊藿的營養組成及抗氧化、抑制骨髓瘤細胞增殖活性分析[D].西安：陜西師范大學，2014.
[11]馬昌豪，劉紅燕，彭慧敏.不同品種玫瑰花多糖含量測定[J].食品與藥品，2011，13（11）：432-434.
[12]崔宏春.綠茶水溶性多糖含量測定方法研究[D].北京：中國農業科學院，2009.
[13]俞 丹，馬 龍，趙 軍，等.瑣瑣葡萄多糖中糖醛酸含量的測定[J].新疆醫科大學學報，2009，32（5）：533-535.
[14]張向萍，王 琦，張華蕓.3，5-二硝基水楊酸比色法測定玉竹滴丸中單糖的含量[J].中國醫院藥學雜志，2009，29（6）：509-510.
[15]朱志川，王曉琳，劉恩荔，等.黨參均一多糖含量測定及安全性研究[J].中華中醫藥學刊，2018（4）：927-931.
[16]劉源才，孫細珍，許銀才.枸杞多糖組成及含量測定方法的改進[J].食品科學，2013（12）：292-295.
[17]Zenaida Guadalupe. Determination of Must and Wine Polysaccharides by Gas Chromatography-Mass Spectrometry （GC-MS） and Size-Exclusion Chromatography （SEC）[J].food chemistry，2012，131（1）：367-374.
[18]王 剛，杜士明，肖淼生，等.山藥多糖的提取分離及山藥總多糖的含量測定[J].中國醫院藥學雜志，2007，27（10）：1414-1416.
[19]薛俊杰.北冬蟲夏草主要有效成分的含量測定研究[D].南京：南京農業大學，2012.
[20]Wenjing Zhang，Delin Sun，Xia Zhao. Microanalysis and preliminary pharmacokinetic studies of a sulfated polysaccharide from Laminaria japonica[J].中國海洋湖沼學報（英文版），2016（1）：177-185.
[21]王佩香.桑枝多糖的初步研究[D].鎮江：江蘇大學，2010.
[22]任紹剛.近紅外光譜技術在藥用真菌云芝活性成分快速無損分析中的應用[D].長春：吉林大學，2008.
[23]李孝棟，陳景山，陳 峰，等.黃芪多糖含量測定的方法學研究[J].世界科學技術，2006，8（2）：35-37.
[24]衛 強，孫曉燕.菊葉中多糖的含量測定方法研究[J].中成藥，2011，33（3）：532-534.
[25]張由芹，王 穎，朱明珠.發酵天龍粉中總多糖的含量測定方法研究[J].山東化工，2017（6）：87-94.
[26]成 芳.南方紅豆杉針葉紫杉烷類化合物、黃酮和多糖含量測定方法及時節變化[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2016.
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