不同配比人參總皂苷、丹皮總苷、丹皮酚含藥血清對H2O2誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷的改善作用研究

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　　摘 要 目的：研究不同配比的人參總皂苷（TGG）、丹皮總苷（TGM）、丹皮酚含藥血清對H2O2誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）損傷的改善作用，篩選最優配比并探討其作用機制。方法：將大鼠隨機分為空白組（蒸餾水）、TGG組（TGG，2.025 g/kg）、TGM組（TGM，4.05 g/kg）、丹皮酚組（丹皮酚，1.08 g/kg），每組12只，每天灌胃相應藥物2次，連續7 d，末次給藥后1 h，腹主動脈取血，制備含藥血清。以HUVEC細胞存活率為評價指標，人參總皂苷、丹皮總苷、丹皮酚含藥血清不同配比為考察因素設計L9（34）正交試驗，優選3種含藥血清的最優配比；將HUVEC細胞分為空白組、模型組、TGG組、TGM組、丹皮酚組、最優配比組，除空白組細胞加入相應培養基外，其余各組均采用1.2 mmol/L H2O2誘導HUVEC損傷，然后TGG組（含藥血清體積分數為0.000 5%）、TGM組（含藥血清體積分數為0.000 5%）、丹皮酚組（含藥血清體積分數為1%）、最優配比組再加入相應藥物含藥血清進行干預。采用微板法和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測各組細胞中乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）、內皮素1（ET-1）的水平。結果：含藥血清最優配比為TGG 0.000 5%、TGM 0.000 5%、丹皮酚1%。與空白組比較，模型組細胞LDH、ET-1水平更高（P<0.01），NO水平更低（P<0.05）；與模型組比較，TGG、TGM、最優配比組細胞NO水平更高（P<0.01），LDH、ET-1水平更低（P<0.05或P<0.01）；與TGG組、TGM組、丹皮酚組比較，最優配比組細胞LDH水平更低（P<0.05或P<0.01），NO水平更高（P<0.05或P<0.01）。結論：TGG、TGM、丹皮酚聯合應用對H2O2誘導的HUVEC損傷具有良好的改善作用，其作用機制與降低LDH、ET-1水平和升高NO水平有關。
　　關鍵詞 人參總皂苷；丹皮總苷；丹皮酚；聯合應用；含藥血清；配比；人臍靜脈內皮細胞
　　Study on Improvement Effects of Different Proportions of Total Ginsenoside of Ginseng， Total Glucosides of Moutan Cortex and Paeonol Containing Serum on HUVEC Injury Induced by H2O2
　　ZHANG Liuji1，2，WANG Jianxia2，LI Kaiyan1，TU Wanqian1（1.Henan Provincial Academy of TCM， Zhengzhou 450004， China；2.College of Pharmacy， Henan University of TCM， Zhengzhou 450008， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To study improvement effects of different proportions of total glucosides of ginseng （TGG）， total glucosides of moutan cortex （TGM） and paeonol containing serum on the injury of human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） injury induced by hydrogen peroxide （H2O2）， screen the optimal proportion and investigate its mechanism. METHODS： The rats were randomly divided into blank group （distilled water）， TGG group （TGG， 2.025 g/kg）， TGM group （TGM， 4.05 g/kg） and paeonol group （paeonol， 1.08 g/kg）， with 12 rats in each group. They were given relevant medicine twice a day for consecutive 7 days. 1 h after last medication， the blood samples were collected via abdominal aorta to prepare drug containing serum. Using survival rate of HUVEC as evaluation indexes， different proportions of TGG， TGM and paeonol containing serum as factors， L9（34） orthogonal test was designed to optimize the optimal proportion of 3 kinds of drug containing serum. HUVEC were divided into blank group， model group， TGG group， TGM group， paeonol group and optimal proportion group. Except that blank group were treated with relevant medium， other group were treated with 1.2 mmol/L H2O2 to induce HUVEC injury， and then TGG group （volume fraction of drug containing serum was 0.000 5%）， TGM group （volume fraction of drug containing serum was 0.000 5%）， paeonol group （volume fraction of drug containing serum was 1%） and optimal proportion group were intervened with drug containing serum. The levels of LDH， NO and ET-1 in cells were detected by microplate method and ELISA. RESULTS： The optimal proportion of drug containing serum were TGG 0.000 5%， TGM 0.000 5% and paeonol 1%. Compared with blank group， the levels of LDH and ET-1 were higher in model group （P<0.01）， while NO level was lower （P<0.05）. Compared with model group， the levels of NO were higher in TGG group， TGM group and optimal proportion group （P<0.01）， while the levels of LDH and ET-1 were lower （P<0.05 or P<0.01）. Compared with TGG group， TGM group and paeonol group， the level of LDH was lower in optimal proportion group （P<0.05 or P<0.01）， while the level of NO was higher （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TGG and TGM combined with paeonol can significantly improve HUVEC injury induced by H2O2， and the mechanism of which may be associated with the decrease of LDH and ET-1 and the increase of NO. 　　KEYWORDS Total glucosides of ginseng； Total glucosides of moutan cortex； Paeonol； Combined use； Drug containing serum； Proportion； Human umbilical vein endothelial cell
　　心肌缺血（Myocardial ischemia）是指心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝異常，不能維持心臟正常工作的一種病理狀態。心肌缺血是多種心臟疾病的初始階段，其發病率和病死率隨著我國人口老齡化進程的加劇而呈逐年上升的趨勢，嚴重影響人類的身體健康和生活質量[1]。
　　人參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根莖。人參皂苷類成分是人參的主要有效成分，具有抗心肌缺血的作用，其機制可能通過減少心肌耗氧，減慢心率，增強心肌收縮力等，保護心肌組織[2]。牡丹皮為毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮。丹皮總苷和丹皮酚是牡丹皮中的主要有效物質，芍藥苷又是丹皮總苷中含量最高的化合物[3]。相關研究發現，丹皮總苷和丹皮酚具有抗缺血再灌注性損傷的作用[4-8]。人參大補元氣、復脈固脫，牡丹皮活血化瘀、清熱涼血，二者配伍，標本兼治、通補結合，具有益氣通絡、活血化瘀的作用[9]。本課題組前期研究也發現，人參、牡丹皮功效部位提取物配伍使用具有抗腦水腫、縮小腦梗死面積、抗血栓和改善血流變等活性，其作用強度優于人參總皂苷（TGG）、丹皮總苷（TGM）和丹皮酚單獨使用[10]。因此，筆者推測人參、牡丹皮功效部位提取物可能具有抗心血管疾病的作用。
　　血管內皮細胞是介于血流和血管壁組織之間的一層單核細胞，內皮受損后，血液中增加的脂質會通過受損的內皮進入到血管壁，沉積于血管內皮下，使血管內皮增厚、變硬，血管的彈性變差，在外界因素的刺激下容易出現血管痙攣，影響血液供應，導致心肌缺血缺氧的發生，引發心血管疾病[11-13]。本文通過H2O2誘導建立人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）損傷模型，灌胃給藥大鼠制備TGG、TGM、丹皮酚的含藥血清，研究不同配比人參總皂苷、丹皮總苷、丹皮酚含藥血清對H2O2誘導的HUVEC損傷的改善作用，篩選最優配比并探究其抗心肌缺血的可能作用機制。
　　1 材料
　　1.1 儀器
　　ELX800全功能酶標儀（美國Bio-tek公司）；HF160W CO2培養箱（上海力申科學儀器有限公司）；CKX53倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；2K15冷凍離心機（德國Sigma公司）。
　　1.2 藥品與試劑
　　人參（批號：160711）、牡丹皮（批號：160402）均購自河南千方藥業有限公司，經河南省中醫藥研究院張留記研究員鑒定為真品；MTT（美國Amresco公司，批號：6041053）；二甲基亞砜（DMSO，天津市風船化學試劑有限公司，批號：20170515）；H2O2（派尼化學試劑廠，批號：20160508）；DMEM/F12培養基（博士德生物工程有限公司，批號：08H17B04、13I06A74）；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：20171107、13D17B21）、胰蛋白酶消化液（胰蛋白酶0.25%，批號：T5016）均購自北京索萊寶科技有限公司；澳洲新生胎牛血清（江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司，批號：S171204F）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號：20180619）、一氧化氮（NO）試劑盒（批號：20180530）均購自南京建成生物工程研究所；內皮素1（ET-1）試劑盒（武漢云克隆科技股份公司，批號：L190904198）。
　　1.3 細胞
　　HUVEC系購自江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司。
　　1.4 動物
　　60只SPF級SD大鼠，♂，體質量約200 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產許可證號：SCXK（魯）2014-0007。
　　2 方法與結果
　　2.1 TGG、TGM、丹皮酚的制備
　　2.1.1 TGG的制備 將1 840 g人參藥材粉碎后，加5倍量70%的乙醇，浸泡1 h，提取2次，每次1 h，過濾，濾液回收至無醇味后濃縮；再加1倍量的蒸餾水在室溫下靜置過夜，過濾，濾液4 000 r/min離心30 min，上清液過大孔吸附樹脂，依次用蒸餾水、5%乙醇、70%乙醇、80%乙醇洗脫，回收70%乙醇洗脫液乙醇，濃縮成浸膏備用[14]，即得TGG 57.11 g。1 g TGG相當于原藥材31 g，其中人參皂苷Rg1含量為0.148%、人參皂苷Re含量為0.119%、人參皂苷Rb1含量為0.262%。
　　2.1.2 TGM的制備 將700 g牡丹皮藥材粉碎后，加70%乙醇提取2次，濾液回收至無醇味后濃縮；加1倍量的蒸餾水在室溫下靜置過夜，過濾，濾液4 000 r/min離心30 min，上清液過大孔吸附樹脂，依次用蒸餾水、5%乙醇、40%乙醇、80%乙醇洗脫，回收40%乙醇洗脫液乙醇，濃縮成浸膏備用[14]，即得TGM 22.85 g。1 g TGM相當于原藥材30.63 g，芍藥苷的含量為9.1%。
　　2.1.3 丹皮酚的制備 將700 g牡丹皮藥材粉碎后，加7 L的蒸餾水，采用水蒸氣蒸餾法[15]，待蒸出液澄清停止加熱，將蒸出液置于冰箱中冷藏48 h，過濾，所得結晶于40 ℃下減壓干燥，即得丹皮酚8.58 g。1 g丹皮酚相當于原藥材81.6 g，丹皮酚含量為1.23%。
　　2.2 溶液的制備
　　2.2.1 TGG溶液 稱取“2.1.1”項下TGG浸膏806 mg，蒸餾水加熱溶解，制備成質量濃度為31 mg/mL的溶液。 　　2.2.2 TGM溶液 稱取“2.1.2”項下TGM浸膏1 716 mg，蒸餾水加熱溶解，制備成質量濃度為66 mg/mL的溶液。
　　2.2.3 丹皮酚溶液 稱取“2.1.3”項下丹皮酚粉末57.2 mg，加入26 mL 5%的羧甲基纖維素鈉助懸，制備成質量濃度為2.2 mg/mL的溶液。
　　2.3 大鼠含藥血清的制備
　　將大鼠隨機分為空白組（蒸餾水）、TGG組（TGG，2.025 g/kg，按生藥量計，下同）、TGM組（TGM，4.05 g/kg）、丹皮酚組（丹皮酚，1.08 g/kg）各12只。各組大鼠每天早晚灌胃1次，連續給藥7d。末次給藥1 h后，腹主動脈取血[16]，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.2 μm微孔濾膜過濾，分裝封口后于-80 ℃保存。
　　2.4 統計學方法
　　采用統計軟件SPSS 19.0進行統計分析，計量數據以x±s表示，采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD法進行組間比較，反之，采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。
　　2.5 H2O2造模濃度的篩選
　　采用MTT法[17]篩選H2O2的造模濃度，取處于對數生長期的HUVEC，按2.5×105 mL-1接種于96孔板，每組設6個復孔，5%CO2、37 ℃培養24 h，分別加入0（空白）、1.1、1.2、1.4、1.8 mmol/L H2O2于含10%胎牛血清的DMEM培養基，培養24 h后分別加入20 μL 5 g/L MTT，培養4 h后，棄上清液，加入150 μL DMSO室溫避光振蕩10 min，于酶標儀570 nm處測定吸光度（OD）值并計算細胞存活率。細胞存活率（%）=試驗組OD值/空白組OD值×100%。結果，H2O2濃度在1.1～1.8 mmol/L時，隨著H2O2濃度的增加，細胞存活率不斷減小，說明H2O2對細胞有損傷作用。綜合考慮，選用存活率為60%左右的1.2 mmol/L作為損傷模型的H2O2濃度。
　　2.6 TGG、TGM、丹皮酚給藥濃度的篩選
　　HUVEC以2.5×105 mL-1接種于96孔板培養24 h后，將其分為空白組（15%空白血清）、模型組（15%空白血清+1.2 mmol/L H2O2）、TGG不同給藥濃度組[體積分數為0.000 1%、0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的TGG血清（空白血清補足至15%，下同）+1.2 mmol/L H2O2]、TGM不同給藥濃度組（體積分數為0.000 1%、0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的TGM血清+1.2 mmol/L H2O2）、丹皮酚不同給藥濃度組（體積分數為0.000 1%、0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的丹皮酚血清+1.2 mmol/L H2O2）每組3個復孔，培養24 h后，MTT法檢測OD值并計算細胞存活率。結果，與空白組比較，模型組細胞存活率顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，TGG各組存活率均顯著升高（P<0.05），且含藥血清為0.000 1%時，細胞存活率最高；TGM 0.000 1%、0.01%、0.1%、1%組存活率顯著升高（P<0.05或P<0.01），且含藥血清為0.000 1%時，細胞存活率最高；丹皮酚0.000 1%、0.1%、1%組存活率顯著升高（P<0.05），且含藥血清為1%時，細胞存活率最高。因此，TGG、TGM、丹皮酚最優給藥濃度分別為0.000 1%、0.000 1%、1%。 TGG、TGM、丹皮酚不同給藥濃度下細胞存活率測定結果見表1。
　　2.7 正交試驗篩選含藥血清最優配比
　　2.7.1 正交試驗 根據“2.6”項下TGG（A）、TGM（B）、丹皮酚（C）的含藥血清體積分數范圍，以細胞存活率為評價指標，設計L9（34）正交試驗，篩選含藥血清最優配比。因素與水平見表2，正交試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。
　　2.7.2 結果分析 根據表3和表4結果，以細胞存活率為評價指標，各因素對細胞存活率的影響效果依次為C>A>B，A、C因素對細胞存活率有顯著影響（P<0.05），選用各因素的最優水平A3B3C2作為含藥血清最優配比（TGG 0.000 5%，TGM 0.000 5%，丹皮酚1%）。
　　2.8 驗證試驗
　　按“2.7.2”項下最優含藥血清配比進行3次驗證試驗。結果，3次試驗的細胞存活率分別為95%、92%、90%，表明最優含藥血清配比條件合理，重現性好。
　　2.9 最優含藥血清配比作用下細胞LDH、NO、ET-1水平的測定
　　細胞以2.5×105 mL-1接種于96孔板培養24 h后，分為空白組（15%空白血清）、模型組（15%空白血清+1.2 mmol/L H2O2）、TGG組（0.000 5%）、TGM組（0.000 5%）、丹皮酚組（1%）、最佳配比組，每組平行5份，分別加入對應含藥血清，孵育24 h后，收集細胞培養上清液，按相關試劑盒要求檢測細胞上清液中LDH、NO和ET-1的水平。各組細胞LDH、NO、ET-1水平的測定結果見表5。
　　3 討論
　　LDH是機體能量代謝中的一種重要酶，其活性的改變直接影響機體的能量代謝。LDH 作為細胞質中的酶，當細胞受損時才可能大量溢出，LDH增加可反映細胞膜的損傷，其外漏的程度也可間接反映心肌再灌注受損程度[18]。NO和ET是內皮細胞釋放的兩種主要血管活性物質。NO具有刺激血管平滑肌舒張，抑制血小板聚集以及抑制內皮細胞增殖等作用；ET-1是收縮血管物質，其通過刺激血管平滑肌細胞增殖，參與并促進高血壓病的發生和發展，除了直接收縮血管外，還能促進其他收縮血管物質產生，如血管加壓素、兒茶酚胺、腎上腺皮質激素等[19]。 　　血清藥理學是近年來提出的一種針對中藥復方研究的藥理學方法，中藥提取物灌胃大鼠后經過吸收、分布、代謝、排謝等體內過程，再取大鼠含藥血清進行藥理學實驗，比較接近藥物體內環境中產生藥理作用的真實過程，排除了中藥粗制劑雜質的影響，在理論上更具科學性和真實性[20]。本研究采用H2O2誘導建立HUVEC損傷模型，用TGG、TGM、丹皮酚含藥血清單獨作用于HUVEC損傷細胞，細胞存活率明顯升高，得出TGG、TGM、丹皮酚具有促進細胞增殖的作用。試驗初期，筆者設計的按生藥比例混合同時灌胃TGG、TGM、丹皮酚，制備混合含藥血清，但結果并沒有3者單獨制備含藥血清更好，故有必要檢測TGG、TGM、丹皮酚不同配比對HUVEC細胞增殖的影響，從而獲得最優含藥血清配比；經正交試驗得出最優含藥血清配比為TGG 0.000 5%、TGM 0.000 5%、丹皮酚1%；最優配比提高了HUVEC細胞存活率，可能與降低LDH、ET-1水平及提高NO的釋放量有關。
　　綜上所述，TGG、TGM、丹皮酚聯合應用對H2O2誘導的HUVEC損傷具有良好的改善作用，由于藥物經過大鼠的體內代謝，獲得的含藥血清中可能發生了化學成分及含量的改變，故需要后期采用薄層色譜法、液質聯用等技術，對TGG、TGM、丹皮酚含藥血清的最優配比進行定性定量分析，以期為開發抗心肌缺血藥物提供試驗基礎。
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