茄褐紋病菌的分離鑒定及培養基篩選
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摘 要：對茄褐紋病菌的形態及適宜培養基類型進行了分析，在茄子的不同發病部位分離出α型、β型2種分生孢子;實驗結果顯示，燕麥培養基是最適宜褐紋病菌產孢的培養基，其次為PSA。
關鍵詞：茄褐紋病菌;分離鑒定;培養基;篩選
中圖分類號 S436.411 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）10-0074-03
褐紋?。≒homopsis vexans）是茄子重要的病害之一，主要危害茄子果實，影響果實的商品性。一般造成果腐發生率在20%～30%[1]，嚴重的高達80%[2，3]，茄子采種田因褐紋病的大發生而導致種子嚴重減產，甚至絕收。
茄褐紋病菌屬半知菌亞門球殼孢目擬莖點霉屬，病斑上產生的黑色分生孢子器初埋生于寄主表皮下，成熟后突破表皮而外露;孢子器單獨地生子座上，呈凸透鏡形，具有孔口，在自然狀態下，Phomopsis的分生孢子器多數僅含有α-型孢而無β-型孢，年佳續[4]綜合論述了擬莖點霉屬的檢測技術，認為形態學鑒定的傳統方法仍是主要鑒定方法之一。羅利娟[5]對8種擬莖點霉在不同培養條件下的產孢情況進行了研究，以其解決自然條件下擬莖點霉屬的鑒定問題。陳永青、姜子德[6，7]分別用分子生物學的方法對多種擬莖點霉屬真菌進行了系統研究，結果表明，Phoma與Phomopsis兩屬之間缺乏明顯的區分界限，在Phomopsis的分類地位上仍存在著界限模糊的問題。周永力[8]對Phomopsis的個體發育做了較為具體的闡述，主要涉及人工培養條件下的Phomopsis的產孢形式、孢子形態及菌落的生長特點等方面。油球是Phomopsis屬的一個穩定的特征，可作為該屬的判斷依據。溫度成為影響孢子類型產生不同的主要因素，傳統觀點認為，不同類型的孢子形態的產生是與所發病的植株部位有關，在自然狀態下，Phomopsis的分生孢子器大多僅含有α-型孢而無β-型孢。本研究通過對采集樣本的徒手切片、鏡檢，以及篩選適宜培養基等方法，在較短時間內用較為經濟的手段，對茄褐紋病菌進行準確的初判，并對茄褐紋病菌的產孢條件進行了進一步研究。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 供試菌株 HA、HB采自安徽合肥，HY采自安徽和縣。
1.1.2 供試培養基 PDA培養基。
1.2 儀器及試劑 光學顯微鏡，顯微攝像顯微鏡 （OLYMPUS），解剖刀，鑷子，剪刀，培養皿，載玻片，蓋玻片，恒溫箱。
1.3 實驗方法
1.3.1 病原菌分離純化 采用PDA培養基進行常規組織分離法，于25℃培養純化，記錄菌落的形態和顏色，同時對病組織進行徒手切片、鏡檢，觀測病原菌形態。并按柯赫氏法則[9]加以確認，獲得茄褐紋病菌菌株3株，分別編號HA、HB、HY。
1.3.2 培養基篩選
1.3.2.1 實驗培養基的制備 （1）PSA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL;（2）PSA+VB1培養基：在原有PDA培養基成分中添加5mg維生素B1;（3）燕麥培養基：燕麥片30g，瓊脂20g，水1000mL;（4）胡蘿卜培養基：200g胡蘿卜榨汁，25g瓊脂，水1000mL;（5）大豆培養基：干豆140g浸泡數小時后磨漿榨汁，瓊脂4g，水1000mL;（6）玉米培養基：玉米粉300g，瓊脂17g，水1000mL;（7）蛋白胨培養基：蛋白胨5g，蔗糖10g瓊脂14g，水1000mL;（8）查彼培養基：蔗糖30g，硝酸鈉2g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，瓊脂17g，水1000mL;（9）茄汁培養基：茄子200g榨汁，瓊脂25g，水1000mL。
1.3.2.2 菌絲生長速率的測定 將茄褐紋病菌菌株HA、HB、HY分別在PDA斜面上活化3d，然后轉移至PSA平板上培養5d。在培養好的菌落平板上沿菌絲生長邊緣用打孔器打直徑為6mm的小菌碟，分別移置不同培養基平板的中央，3次重復。25℃條件下恒溫培養，3d后按十字交叉法測量菌落的直徑，取平均值，測定生長速率。
2 結果與分析
2.1 茄褐紋病病原的鑒定 茄褐紋病菌存在2種分生孢子：α型及β型分生孢子。α-型孢子為單孢，無色、長圓柱形、球形、梭形，1端或2端較尖，有1～2個大油球或兩端各聚集多個小油球。β型呈細長線狀，并在一端彎曲成鉤，兩者均為無色單胞。經鏡檢得知，寄主發病部位不同，其分生孢子類型有明顯差異：果實上分離的分生孢子有2種類型，其中多數為α型分生孢子，伴有少量的β型分生孢子;從莖稈上的病斑采集到的都是β型分生孢子;葉片上的均為α型分生孢子。各部位分生孢子形態見圖1，分生孢子器形態見圖2。
2.2 培養基的篩選 3個褐紋病菌菌株在9種培養基上的培養性狀及產孢情況結果見表1，菌株生長情況結果見圖3。由表1可知，能夠產孢的培養基有PSA、燕麥、玉米、胡蘿卜，其產孢量依次為燕麥>PSA≥玉米>胡蘿卜，產孢時間除胡蘿卜培養基的時間在15d以上外，其他3種培養基的產孢時間都在10d以上。由圖3可知，菌絲生長較好的培養基種類有PSA、茄汁、玉米，不適合菌絲生長培養基為查彼和蛋白胨。3個菌株在不同的培養基上的菌絲生長情況存在差異，HA菌絲生長最適的培養基為茄汁培養基，HB最適的為玉米培養基，HY最適的為PSA培養基。HB在9種培養基上的菌絲生長情況總體上優于HY、HA，HA的菌絲生長為最低，在產孢情況上，3個菌株的表現較為一致。
3 討論
茄褐紋病菌2種類型的分生孢子（β型和α型）2端的油球，已經成為Phpmopsis的分類標志。筆者在實驗中觀察到，α型分生孢子的油球多數情況下保持在2個（1端1個），在極少數情況下，可以觀察到有3個油球存在。這一特征不僅是自然條件下形成的分生孢子，而且是人工條件下形成的分生孢子所共有的。而對于β型分生孢子，除在自然條件下較少見到外，因其不具有生殖能力，所以在一般人工培養條件下無β型分生孢子出現。目前，國內對茄褐紋病菌的分類研究仍較少，因實驗采集的菌株較少，研究存在著很大的局限性，有待于進一步深入。 不同的褐紋病菌株在PSA培養基上的生長形態及生長速率不同，而且對于不同的菌株，最適宜生長的培養基類型也不同。菌株的致病力與其在人工條件下的生長狀態無必然聯系。在人工培養下，褐紋病菌的產孢能力存在明顯下降現象，如何使褐紋病菌株在人工條件下較長時間的保持其在自然條件下的生活力，成為研究和保存工作的關鍵。羅利娟研究發現，苜蓿煎汁+Czapek培養基最有利于載孢體的產生，而OMA培養基一直都被認為是擬莖點霉屬真菌產生孢子的最佳培養基，茄褐紋病菌在OMA培養基上的產孢表現優于其他培養基，但添加茄汁的培養基并不能促進褐紋病菌產孢。因本次所采用的培養基種類有限，相關研究也有待今后進一步深入。
4 結論
根據分離結果及人工培養，按照柯赫氏法則驗證，從茄子病組織中分離到3個褐紋病菌株HA、HB、HY。從不同部位的病斑上采集的孢子類型不同，果實上為2種，α型和β型;葉片上為α型;莖桿上為β型。
PSA培養基適合作為褐紋病菌的培養使用，燕麥培養基適合作為褐紋病菌的產孢培養基和保存用。
參考文獻
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[4]胡佳續，趙璟源，牛春敬，等.擬莖點霉屬真菌檢測技術研究進展.[J].植物檢疫，2015，29（6）：16-22.
[5]羅利娟，習根平，姜子德，等.純培養擬莖點霉屬真菌的產孢條件[J].菌物學報，2004，23（2）：219-225.
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[8]周永力，呂國忠，劉偉成，等.球殼孢目真菌個體發育研究Ⅰ：殼二胞等四屬[J].菌物系統，1998，17（3）：199-205.
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