響應面法優化軟棗獼猴桃組培增殖培養基

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　　摘要：目的：研究優化軟棗獼猴桃的增殖培養基。方法：以軟棗獼猴桃初代培養的不定芽為外植體，利用響應面法對其增殖培養基進行優化。在單因素的試驗基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以6-BA、IAA、IBA為試驗因子，植株再生頻率為響應值，進行三因素三水平的試驗設計。結果表明：三因素對植株再生頻率的影響力大小為6-BA>IBA>IAA，最終得到的二元回歸方程顯示，一步成苗的培養基優化結果為MS+6-BA1.61mg/L+IAA0.55 mg/L+IBA0.33 mg/L。在此條件下，最佳再生頻率預測值為7.27，實際操作結果為7.23，說明該方程預測與實際試驗擬合度較好，該優化方案有實際意義和可行度。
　　關鍵詞：響應面;優化;增殖系數;軟棗獼猴桃
　　基金項目：吉林省重點科技攻關項目：編號20140204030NY，編號20140101271JC; 科技創新基金項目：編號（2017496）
　　中圖分類號： Q949.758.2                              文獻標識碼：  A                   DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.02.024
　　 軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）為多年生落葉藤本，在我國主要分布在東北、華北、西北及長江流域，在吉林省主要分布在長白山區各縣，是著名的經濟野果[1]。野生軟棗獼猴桃酸甜可口，富含營養成分，如黃酮及苷、氨基酸、有機酸、油脂及多糖、蛋白質、脂肪、維生素A、維生素C、葉綠素、果膠、胡蘿卜素等[2，3]，還可加工成果脯、果酒、果汁等產品，有良好的食用價值。其根、莖、葉均可入藥，可治療消化不良、腹瀉、嘔吐和風濕性關節痛，有抗衰防癌的功效[4]，具有良好的藥用價值和經濟價值。
　　 軟棗獼猴桃的常見繁殖方法有種子繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖，但種子繁殖生長周期長，扦插和嫁接成活率低[5]，組織培養是快速繁殖大量植株并保留其優良性狀的有效途徑。目前，關于軟棗獼猴桃的組培已有一些研究報道，在增殖階段的研究中[6-9]，一般通過調整植物生長調節劑的種類及濃度，來篩選增殖系數更高的培養基，但增殖系數不夠理想。增殖培養常用的植物生長調節劑有6-BA、IBA、NAA、IAA、KT等，但研究其中交互作用的文章未見報道。本次試驗用響應面的研究方法，選用6-BA、IAA、IBA三種植物生長調節劑，以初代培養產生的不定芽為試驗材料，探究最適宜軟棗獼猴桃增殖的培養基，以及三種植物生長調節劑之間的交互作用，以期獲得高于前人研究的增殖系數，在一定程度上優化軟棗獼猴桃的快繁體系，為今后的相關研究提供理論實踐基礎。
　　1 試驗材料與方法
　　1.1試驗材料
　　 外植體為長白山野生軟棗獼猴桃帶芽莖段，于2017年5月采自吉林長白山地區，經消毒后接入誘導培養基：MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L中，培養30d后，選取長勢一致的不定芽為試驗材料。
　　1.2 試驗方法
　　1.2.1單因素試驗 為探究每種生長激素的不同濃度對外植體產生的影響，以MS為基本培養基，將6-BA、IBA、IAA分別設置5種濃度：6-BA（0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，2.0mg/L，2.5mg/L）;NAA（0.05mg/L，0.10mg/L，0.20mg/L，0.40mg/L，0.80mg/L）;IAA（0.05mg/L，0.10mg/L，0.20mg/L，0.40mg/L，0.80mg/L）。將不定芽分別接種到培養基內，每個處理接10個不定芽，3次重復，30d后，統計增殖系數。增殖系數=培養30天后不定芽總數/接種的不定芽數。
　　1.2.2 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上，應用響應面分析法，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以6-BA、IAA、IBA為試驗因子，增殖系數為響應值，設計三因素三水平的優化試驗，見表1，每個水平處理10個組培苗，培養周期為30d。
　　1.3 培養條件
　　 基礎培養基為MS培養基，蔗糖30g/L，瓊脂粉8g/L，pH值為5.8～6.0。培養環境為溫度（25±2）℃，光照強度2000lx，每天光照14h。
　　1.4 數據分析
　　 采用SPSS20.0和Design-Expert8.0.6軟件對數據進行整理與分析。
　　2 結果與分析
　　2.1單因素試驗結果
　　2.1.1 6-BA濃度對增殖系數的影響 由表2可知，6-BA對不定芽增殖的效果較顯著，6-BA濃度為0.5、1.0mg/L時，產生的新芽葉片為嫩綠色，芽細弱矮小，長勢不佳。隨著濃度的升高，增殖系數隨之升高，6-BA濃度為2.0mg/L時，達到了最佳增殖系數4.07，新生芽多，莖較粗壯，與其他處理有顯著差異。但濃度超過2.5mg/L，增殖率下降，植株葉片邊緣發黃，芽較細弱，長勢不佳，可見6-BA濃度過高，對芽苗增殖分化有抑制作用。
　　2.1.2 IAA濃度對增殖系數的影響 由表3可知，低濃度的IAA對不定芽幾乎無促進增殖的作用，新生芽極少，且莖段及葉片呈白綠色，長勢不佳。IAA濃度越高，不定芽增殖系數越高，當IBA濃度為0.40mg/L時，最佳增殖率為2.37，芽苗翠綠色，長勢健壯。
　　2.1.3 IBA濃度對增殖系數的影響 由表4可知，低濃度的IBA對不定芽增殖的促進作用較弱，芽呈嫩綠色，較細弱，隨著IBA濃度的升高，增殖系數有所上升，新生芽漸多，且翠綠粗壯。IBA濃度為0.20mg/L、0.40mg/L時增殖系數無顯著差異，新生芽較多，芽長勢健康。IBA濃度為0.40mg/L時，增殖系數最佳，植株健壯，長勢良好。 　　2.2 軟棗獼猴桃增殖培養基的優化試驗結果
　　2.2.1回歸方程分析  以6-BA（X1）、IAA（X2）、IBA（X3）為自因素，以植株再生頻率（Y）為響應值，設計了17組試驗，5個中心試驗，見表5。得到回歸方程為：Y=7.04+0.69X1+0.33X2+0.51X3+0.20X1X2+0.12X1X3-0.10X2X3-1.76X12-1.03X22-0.51X32。R2=0.9694，說明試驗值與預測值有較高的相關性，該回歸模型的P值<0.0001，有極顯著性。失擬項F值=0.0551>
　　0.05，不顯著。說明該方程模型擬合度良好，試驗誤差小。表6中，X1、X3、X12、X22均呈極顯著影響（P<0.01），X2、X32呈顯著影響（P<0.05）。X1X2、X2X3、X1X3不顯著。說明三種單因素對植物的增殖系數有顯著影響，但三者之間的交互作用不顯著。單因素對響應值的影響力大小為6-BA>IBA>IAA。
　　2.2.2響應面分析 等高線的形狀可體現兩因素交互作用的大小，圓形表示交互作用小，橢圓形則相反[10]。響應面的坡度變化可體現因素對響應值的影響力，坡度平緩說明影響力小，坡度陡說明影響顯著[11]。由圖1～圖3可知，IAA與6-BA的曲面最陡，呈明顯凸面，6-BA與IBA的曲面偏陡，IBA與IAA的曲面相對平緩。由此可知，三種因素的交互作用對響應值的影響力大小為X1X2>X1X3>X2X3。
　　2.2.3 模擬方程的驗證試驗 通過二次回歸方程的分析可得出軟棗獼猴桃增殖培養基中，三種植物生長調節劑的最佳濃度為：6-BA1.61mg/L，IAA0.55 mg/L，IBA為0.33mg/L，最佳增殖頻率預測值為7.27。對該模型進行三次驗證試驗，每次處理10個不定芽，得出的三次結果為：7.3，6.9，7.5，平均結果為7.23。與方程預測值接近，說明該方程預測與實際試驗擬合度較好，該優化方案有實際意義和可行度。
　　3 討論
　　 增殖培養是組培試驗中至關重要的階段，植物生長調節劑的種類及濃度對不定芽的分化、增殖及組培苗的長勢有著不同程度的影響[12.13]。本次試驗以初代培養誘導出的不定芽為試驗材料，通過調整6-BA、IAA、IBA三種植物調節劑的濃度，篩選出了適宜軟棗獼猴桃增殖的培養基，最佳增殖系數為7.23。有研究用2mg/L的6-BA和0.2mg/L的IBA對軟棗獼猴桃進行增殖培養，得到的最佳增殖系數為5.0[14]。也有研究用到0.8mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA，得到最佳增殖系數為4.84[15]。還有研究篩選的最佳增殖培養基為MS+BA 1.5mg·L-1+IBA 0.1mg·L-1，增殖系數達4.5[16]。本次的試驗結果明顯高于上述研究，可能是因為所選的3種植物生長調節劑間相互作用對不定芽有更好的促進作用，其濃度經過Design-Expert8.0.6所得方程更為精確的計算，所以有了很好的增殖效果，高于部分前人的研究結果。
　　 在單因素的試驗過程中，發現低濃度的植物生長調節劑對不定芽促進作用不顯著，植株長勢細弱，可能因濃度未達到其生長分化的需求量。但6-BA濃度為2.5mg/L，IBA濃度為0.8mg/L時，增殖率都有所下降，且試管苗葉片發黃卷曲，莖段細弱，長勢不佳。這與前人研究結果一致，該研究發現，當添加的6-BA和IBA的濃度逐漸高于2.0mg/L和0.2mg/L 時，叢生芽增殖系數呈下降趨勢[17]。說明高濃度的生長調節劑對試管苗的增殖分化促進效果減弱，抑制其增殖生長，在組培試驗中，要控制好植物生長調節劑的濃度，才可得到最佳的試驗效果。
　　 響應面法是一種綜合試驗設計和數學建模的優化方法，通過對具有代表性的局部各點進行試驗，回歸擬合全局范圍內因素與響應值間的函數關系，計算各因素最佳水平值[18]。相比于常用的正交設計，響應面法可分析幾種因素間的交互作用，以達到較全面地反映各因素水平的效果?？稍谡麄€區域上因素的最佳組合和響應值的最優值，且實驗次數少，節省了試驗成本和時間。
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　　 作者簡介：趙春莉，博士，副教授，研究方向：觀賞植物資源引種馴化及繁殖技術。
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