Box-Benhnken響應曲面法優化五味子中木脂素的微波提取工藝

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　　摘要：目的：利用響應曲面法優化五味子果實中木脂素微波提取工藝。方法：在單因素試驗基礎上，根據Box-Benhnken中心組合設計原理，以乙醇濃度、料液比、提取次數、提取功率為自變量，木脂素含量為響應值，設計4因素3水平響應面分析試驗來確定最佳提取工藝。結果：響應面優化的最佳提取工藝為乙醇濃度84%，料液比為1∶15，提取次數為2次，提取功率為800W。結論：響應面分析所得二次模型方程能較好地預測實驗結果，實驗設計和響應曲面法優化得到的提取工藝參數準確可靠，該研究可為從北五味子中提取木脂素成分提供一個較為有效的方法。
　　關鍵詞：五味子;木脂素;響應曲面法
　　基金項目：吉林農業科技學院大學生科技創新科研項目（2017063）;吉林農業科技學院博士啟動基金項目（2017411）
　　中圖分類號： TQ460.6                                  文獻標識碼：  A                          DOI編號：   10.14025/j.cnki.jlny.2019.06.014
　　五味子（Schisandra chinensis）是木蘭科五味子屬植物。五味子中有效成分木脂素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝降酶等功效[1]。一直以來，對五味子木脂素提取工藝的研究一直在推陳出新，但多以正交試驗方法進行試驗處理，其篩選得到的結果差異性大、重復性差[2]。傳統的提取方法常采用超聲提取法，該工藝的不足在于提取時間長、消耗能源大，而微波提取法是將微波輻射與溶劑萃取相結合，具有提取時間短、溶劑用量少、提取成本低等優點[3-4]。本研究將微波提取法用于五味子果實中木脂素的提取，以五味子中含量高的4種木脂素含量為考察指標，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken試驗設計篩選五味子果實中木脂素的最佳提取工藝，提供一個從五味子中提取木脂素的較為有效的方法。
　　1 材料與儀器
　　1.1 儀器
　　XH-100A微波超聲波合成儀（北京祥鵠科技發展有限公司）、1260型高效液相色譜儀（安捷倫）、R1001-VN型旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）、SHB-III型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）、SE602F型電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）、HP-010型真空泵（天津市恒奧科技發展有限公司）、FB-01T過濾器。標準品五味子醇甲（ZJ0109BA13）、五味子醇乙（PM0303SA14）、五味子甲素（P26M6R1）、五味子乙素（PA0414RA14）購買于上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%。所用試劑均為分析純。
　　1.2 材料
　　五味子2017年6月采自于吉林農業科技學院藥用植物資源圃。經吉林農業科技學院老師李赫男鑒定為五味子科（Schisandraceae）五味子屬（Schisandra）五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）的果實。
　　2 方法與結果
　　2.1 五味子果實的處理
　　將五味子果實粉碎，置于55℃烘箱中烘至恒重，過40目篩后備用。
　　2.2 五味子果實中木脂素含量測定
　　2.2.1 溶液的制備
　　2.2.1.1 對照品溶液 精確稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品各5mg于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度均為0.5mg/mL的標準品溶液，置4℃冰箱中保存[5]。
　　2.2.1.2 供試品溶液制備 精密量取單因素考察和響應面曲線法制得的五味子果實溶液10，進入HPLC檢測其四種木脂素含量。
　　2.2.2 色譜條件 色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6×150mm，5μm）;流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫0～30min 45%A～75%A;30～45min 75%A～100%A;45～55min 100%A;流速1mL/min;柱溫30℃;進樣量10μL;在254nm波長處進行檢測[6-7]，色譜圖見圖1。
　　A：對照品溶液;B：樣品溶液;1.五味子醇甲;2.五味子醇乙;3.五味子甲素;4.五味子乙素。
　　2.2.3 標準曲線的繪制  取配制的對照品溶液，分別進樣2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，按色譜條件進行色譜分析，記錄色譜峰面積，以色譜峰面積（y）為縱坐標，質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，求出各木脂素線性回歸方程，見表1。
　　2.2.4方法學考察
　　2.2.4.1 精密度試驗  分別精密吸取4種對照品溶液，重復進樣5次，進樣量10，按色譜條件進行 HPLC分析，記錄峰面積。結果顯示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD值分別為0.46%、0.88%、0.68%、0.59%（n=5），表明儀器精密度良好。
　　2.2.4.2 重復性試驗  取同一批樣品3份，按“2.2.1.2”方法制備成供試品溶液，按色譜條件進行HPLC分析，記錄峰面積，測得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD值分別為0.72%、0.79%、1.13%、0.97%，表明本方法的重復性良好。
　　2.2.4.3 穩定性試驗  取同一供試品溶液分別放置0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h后按上述色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，計算木脂素含量。結果顯示：供試品溶液中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量的RSD值分別為0.89%、0.78%、1.12%、0.98%（n=5），結果表明，供試品溶液在24h內穩定性良好。 　　2.2.4.4 加樣回收率試驗  精密稱取5份已知上述4種木脂素含量的五味子粉末1.000g，各精密加入適量的對照品溶液，按“2.2.1.2”方法制備樣品溶液，根據上述色譜條件進行檢測分析，測定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量。由測得量和加入量，計算各成分的加樣回收率，結果符合定量測定要求，表明本法準確可靠，詳見表2。
　　3 響應面法優化五味子果實中木脂素的微波提取工藝
　　在微波提取法單因素試驗的基礎上，選取乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、提取次數（X3）、提取功率（X4）四個因素，通過Design-Expert8.0.6軟件進行Box-Benhnken的響應面設計和數據分析，具體試驗因素與各水平值見表3。
　　根據Box-Benhnken的組合設計原理，采用Design-Expert
　　8.0.6軟件設計四因素三水平共29個試驗，其中心點重復5次試驗，以木脂素含量為響應值，具體試驗設計方案與結果見表4。
　　利用Design-Expert8.0.6軟件對表4中的數據進行多元擬合，得到五味子醇甲對乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、提取次數（X3）、提取功率（X4）的二元多項模型方程分別為：
　　Y醇甲=-19.18341+0.15717*X1+0.68745×X2+1.73405*
　　X3+0.017979*X4+2.01500×10-3*X1X2-0.0269*X1X3+1.73225×104*X1X4+0.019755*X2X3-9.69150×10-4*X2X4+7.49500×10-4*
　　X3X4-1.52812×10-3*X12-4.14543×10-3*X22-0.11441*X32-9.11233×10-6*X42;對該模型進行方差分析，結果見表5。從表中可看出模型的F值和P值（F醇甲=3.94、P醇甲=0.0075;F醇乙=10.52、P醇乙<0.0001;F甲素=9.13、P醇甲<0.0001;F乙素=7.59、P醇甲=0.0003），表明模型對提取工藝影響極顯著。R醇甲2=0.8977、R醇乙2=0.9132、R甲素2=0.9012、R乙素2=0.8835，變異系數（C·V%）分別為10%、20.14%、23.95%、31.21%，Radj醇甲2=0.8954、Radj醇乙2=0.8264、Radj甲素2=0.8025、Radj乙素2=0.8671，表明模擬程度良好，試驗誤差較小。根據回歸方程中的各項系數及表5回歸方程的方差結果可知，在所選因素范圍內各個因素對五味子木脂素提取含量的影響順序，五味子醇甲和五味子醇乙：提取濃度>料液比>提取次數>提取功率;五味子甲素和五味子乙素：提取濃度>提取次數>料液比>提取功率。
　　響應面曲面可較直觀的反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應值（木脂素含量）的影響。五味子微波提取的響應面3D圖（略），乙醇濃度對微波提取木脂素含量影響最大，提取功率影響最小。
　　運用Design-Expert8.0.6軟件優化得到的微波提取木脂素最佳提取工藝為乙醇濃度83.97%，料液比為1∶15，提取次數為2次，提取功率為763.24W，在此條件下五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的含量分別為3.8017、0.9158mg/g、0.9792mg/g、2.5823mg/g?？紤]到微波功率參數為整數，將提取條件調整為乙醇濃度84%，料液比為1∶15，提取次數為2次，提取功率為800W。
　　4 結論
　　本研究以五味子中4種含量高的木脂素為測定目標，利用響應曲面法優化微波提取技術提取五味子中木脂素成分，通過四因素、三水平的Box-Benhnken 設計優化得到最佳微波提取工藝，提供一個從五味子中提取木脂素較為有效的方法。
　　經響應曲面法優化后的五味子木脂素微波提取工藝，是以乙醇濃度、料液比、提取次數、提取功率四個因素為最低值和五味子醇乙含量為最高值來進行預測，實現了以五味子為原料提取木脂素成分節省試劑、耗能低、耗時短、效率高等特點，為微波提取五味子中木脂素成分提供一個較為有效的方法。
　　參考文獻
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　　作者簡介：趙大偉，在讀本科生，研究方向：制藥工程。
　　通迅作者：劉俊霞，博士研究生，講師，研究方向：中藥新藥開發與利用。
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