酶-超聲波法提取桑葚中花青素及其穩定性的研究
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【摘 要】 優化酶-超聲波法提取桑葚中花青素的工藝參數并對其穩定性進行研究。采用超聲波提取功率、纖維素酶添加量、提取時間和固液比進行工藝研究。運用光照、溫度、金屬離子等對其穩定性進行研究。確定最佳提取工藝條件為超聲波提取功率180W，纖維素酶添加量8mg/g，提取時間25min，固液比1：20g/mL。花青素對光熱敏感，H2O2和Fe3+對其穩定性影響較大，糖對其穩定性基本無影響。該研究可為桑葚花青素的工業化生產、儲存提供科學依據。
【關鍵詞】 桑葚 ;花青素;超聲波法;穩定性
[Abstract] Optimization of Enzyme - Ultrasonic Extraction of Anthocyanin from Mulberry and Its Stability. Ultrasonic extraction power， cellulase addition， extraction time and solid-liquid ratio were used to study the technology. The stability of light was studied by using light， temperature and metal ion. The optimal extraction conditions were as follows： ultrasonic extraction power 180W， cellulase addition amount 8mg / g， extraction time 25min， solid - liquid ratio 1： 20g / mL. Anthocyanins are sensitive to light and heat， and H2O2 and Fe3+ have a great effect on its stability.
[Keywords] mulberry;anthocyanin;ultrasonic method;stability
桑葚，又叫烏椹、桑椹子、桑棗等，為桑樹的成熟果實。桑葚在食用方面可以為人體提供多種營養，同時含有的蘆丁、花青素等活性物質也可以作為藥材使用。是第一批由國家衛生部認定為“藥食同源”的藥用植物[1]?；ㄇ嗨厥巧］刂兄匾臓I養成分，又稱花色素。它是一種水溶性色素，廣泛存在于植物中[2]。經過對花青素的研究發現：花青素可以通過清除人體內自由基，達到抗衰老、防止細胞發生突變，抗癌的作用[3，4]。目前，桑葚花青素提取方法有樹脂法、水提取等方法。但具有提取率低，時間長等缺點。本實驗采用酶-超聲波聯合提取的方法，利用酶能將大分子物質分解，用纖維素酶對細胞進行破壁，結合超聲波高速振動擊碎和攪拌的作用，提高了花青素的溶出率[5，6]，從而大大降低提取時間，增加其提取效率，為桑葚在食品和藥材方面的利用和開發提供了參考依據。
1 材料與方法
1.1 材料
桑葚：購自浙江省安吉縣，經吉林農業大學楊世海教授鑒定為?？粕偕７N的干燥果實。
1.2 試劑
纖維素酶（30 U/mg）、pH試紙、95%乙醇、濃鹽酸、葡萄糖、醋酸鈉、氫氧化鈉、山梨酸鉀、三氯化鐵、氯化鉀、硫酸銅、亞硫酸鈉、氯化鈉、蔗糖、氯化鎂、過氧化氫、硝酸鋁（以上均為分析純）。
1.3 方法
1.3.1 實驗方法 將桑葚在60℃下烘干，將桑葚粉碎成粉末。精密稱取2g桑葚粉末。加入酶和提取劑（0.1% HCl 溶液 ： 95%乙醇=1 ： 1），放入超聲波提取器里提取一定時間，取出后在轉速為5000 r/min的離心機下離心15 min。取上清液，定容到液體最初體積。取1mL液體各至9mL 的pH4.5和pH1.0緩沖液中，放置 40min后在700nm和510nm處分別測定吸光度。
分別選取提取功率、纖維素酶添加量、提取時間和固液比4個因素進行單因素實驗，考察各因素對桑葚花青素提取的影響，確定正交試驗因素及水平。
1.3.2 花青素提取率的測定方法 pH 的變化不會使干擾的物質發生光譜變化，而花青素會隨其產生變化。因此，pH 示差法是一種檢測花青素含量的良好方法。通過文獻發現，pH示差法的曲線相關系數為0.9935[12]。
1.3.3 酶對花青素得率的影響 按“1.4.1”的方法在固液比為1：20，120W、25℃的條件下超聲波振蕩20 min，一份加入纖維素酶量6mg/g，另一份不加纖維素酶的條件下進行實驗。結果取三次實驗平均值。由結果可知，加入纖維素酶使其花青素得率增加。說明纖維素酶可以提高花青素的溶出率。因此，用酶與超聲波結合的方法能夠提高桑葚花青素的含量。
分析桑葚花青素在變換溫度、氧化劑、防腐劑、糖、等條件下保存率的變化。來研究桑葚中花青素在以上幾個因素影響下的穩定性。各組實驗重復三次。
2 結果與分析
2.1 桑葚花青素提取單因素實驗結果
2.1.1 提取功率對花青素得率的影響 結果所示，花青素得率隨著提取功率的增大而增加。當提取功率為180 W時，花青素得率最大。功率為210W時，花青素含量出現下降趨勢。因為太大的功率使提取環境的溫度升高，從而降解了部分桑葚花青素。
2.1.2 纖維素酶添加量對花青素得率的影響 結果所示，花青素得率隨著纖維素酶添加量的增大而增加。當添加量達到8mg/g后，增加酶的量，花青素的得率基本不變。由于酶與桑葚粉末已經反應完全，桑葚中花青素已完全溶出。 2.1.3 提取時間對花青素得率的影響 結果所示，在超聲振蕩15～20min時，花青素的含量隨振蕩時間的增加而增大。繼續增大振蕩時間，花青素含量基本不變。因為桑葚粉末與酶在一定時間已經反應完全，花青素不會因為時間而繼續溶出。
2.1.4 固液比對花青素得率的影響 結果所示，花青素得率隨著固液比的增大而增加。當固液比為1：20時，花青素含量最大。固液比在1：20～1：30的范圍內，花青素得率出現了下降趨勢。因為大量的溶劑使酶的濃度降低，從而降低了花青素的提取率。
2.2 正交試驗結果
2.2.1 正交試驗結果 由結果可知，提取時間對試驗影響很小;固液比對試驗的影響最大。將得到的單因素的最佳條件，與正交試驗中得到的最佳提取條件下的提取率作對比，發現其最佳提取條件為A2B2C3D2，即超聲波提取功率180 W，纖維素酶添加量8 mg/g，提取時間25 min，固液比1：20 g/mL，花青素得率達到0.352%。
2.3 穩定性實驗結果
2.3.1 溫度對花青素穩定性的影響 由結果可知，在4℃下保藏的桑葚花青素的保存率最高。桑葚花青素的保存率隨溫度的升高緩慢降低。在80℃下保藏的桑葚花青素隨著時間增加保存率急劇下降。這說明高溫對桑葚花青素有降解作用，因此低溫有利于桑葚花青素的保存。
2.3.2 光照對花青素穩定性的影響 由結果可知，在黑暗處放置的桑葚花青素保存率基本保持不變;在室內燈光下桑葚花青素隨著時間的增加保存率逐漸減小;在紫外燈照射下保藏的桑葚花青素的保存率隨時間的延長而急劇下降。說明黑暗環境對桑葚花青素的保存率影響較小，因此避光有利于桑葚花青素的保存。
2.3.3 金屬離子對花青素穩定性的影響 由結果可知，加入A13 +、Na+、Mg2+的桑葚花青素的保存率無明顯變化，加入Cu2 +的桑葚花青素的保存率稍有降低，而加入Fe3+的桑葚花青素的保存率急劇下降。這說明Fe3+對桑葚花青素的穩定性影響很大，這可能由于Fe3+與桑葚花青素形成金屬螯合物，故在生產過程和儲存時避免與鐵器接觸。
2.3.4 氧化劑還原劑對花青素穩定性的影響 由結果可知，加入各種濃度的H2O2的桑葚花青素的保存率都下降明顯，保存率最低達到25.1%，這說明H2O2的存在下桑葚花青素的穩定性極差。這可能由于H2O2進攻桑葚花青素的C位，使桑葚花青素生成查耳酮而發生進一步降解。由結果可知，加入亞硫酸鈉的桑葚花青素隨著時間的增加保存率稍有降低。這說明亞硫酸鈉對桑葚花青素的保存率有所影響，但影響不大。
2.3.5 防腐劑對花青素穩定性的影響 結果可知，加入山梨酸鉀的桑葚花青素的保存率基本保持不變。
2.3.6 糖對花青素穩定性的影響 結果可知，加入葡萄糖和蔗糖的桑葚花青素的保存率基本保持不變。
3 結論
通過正交試驗結果可知影響桑葚花青素的提取的因素順序依次為固液比>提取功率>纖維素酶添加量>提取時間，確定了桑葚花青素最佳提取工藝條件為超聲波提取功率180 W，纖維素酶添加量8 mg/g，提取時間25 min，固液比1：20 g/mL，此時花青素的提取率為0.352%。桑葚花青素穩定性試驗表明， 桑葚花青素對光、熱敏感，應在低溫避光條件下保存;H2O2能夠進攻桑葚花青素的C位使花青素發生降解，Fe3+與桑葚花青素形成金屬螯合物，因此H2O2和Fe3+對桑葚花青素的穩定性很大，使用和儲存過程中應該避免;糖對桑葚花青素的穩定性基本無影響。
參考文獻：
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