酶法輔助提取苦皮藤素工藝優化

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　　摘要：以苦皮藤素（Celastrus angulatus Maxim）根皮為原料，以苦皮藤素得率為指標，對堿性蛋白酶、纖維素酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶4種酶輔助提取苦皮藤素的效果進行比較分析，篩選出酶解效果較好的胃蛋白酶，再通過單因素試驗和正交試驗，優化胃蛋白酶輔助提取苦皮藤素的最佳工藝。結果表明，胃蛋白酶輔助提取苦皮藤素在酶解溫度37 ℃、時間5 h、pH 2.0、加酶量66 000 U/g的條件下效果最好。
　　關鍵詞：酶法;苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim）;苦皮藤素;提取
　　中圖分類號：Q55         文獻標識碼：A
　　文章編號：0439-8114（2019）06-0114-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.06.026           開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
　　Abstract： Celangulin from the root skin of Celastrus angulatus were isolated using an enzye-assisted procedure. By analyzed the effects of alkaline protease， cellulase， pepsin and neutral protease on the extraction of celangulin， Pepsase was selected to optimize the extraction conditions. The results showed that the optimal conditions for celangulin extraction was found to be extraction with enzymatic hydrolysis with 66 000 U/g pepsase at 37 ℃ and pH 2 for 5 h. Under these conditions， the maximum yield of celangulin was obtained.
　　Key words： enzyme; Celastrus angulatus; celangulin; extraction
　　苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim）系衛科南蛇藤屬的一種多年生木質藤本植物，是中國著名的具有開發潛力的殺蟲劑之一[1]。其含有的主要殺蟲有效活性成分為苦皮藤素[2]，其防御病蟲害機理已經取得了很大的進展[3，4]。傳統提取苦皮藤素的方法與工藝，如索氏提取、熱回流提取等已有研究[1，5]，而酶法輔助提取苦皮藤素鮮見報道。酶法輔助提取的原理是酶破壞細胞壁，整個過程反應條件溫和，利用酶的專一性可避免對底物外物質的破壞[6]。該法可以提高產率、縮短時間、降低成本。
　　本試驗采用酶法輔助溶劑提取苦皮藤素，利用堿性、中性與胃蛋白酶、纖維素酶進行輔助提取，優化提取工藝，下一步將對苦皮藤素作為天然植物殺蟲劑的穩定性進行研究，為市場開發植物源殺蟲劑苦皮藤素乳油提供依據?？嗥ぬ偎啬鼙婚_發利用，正是由于其對哺乳動物低毒，在環境中低殘留，在現階段其必將具有更廣闊的研究與應用前景，更對秦巴山區植物種質資源的開發與利用有重要意義。
　　1  材料與方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  試驗材料  苦皮藤根皮粉末：苦皮藤采集于陜西省商洛市黑龍口鎮，人工剝取苦皮藤根皮，陰涼條件下風干，粉碎機粉碎。
　　1.1.2  試劑與儀器  試劑：堿性蛋白酶（化學純）、中性蛋白酶（化學純）、胃蛋白酶（化學純）、纖維素酶（化學純），北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉（分析純）。儀器： 全自動固液萃取儀（型號：B-811，步琦實驗室設備貿易（上海）有限公司）、電子天平（型號：BSA223S，上海智泰電子科技有限公司）、恒溫水浴鍋（型號：HH-S，北京科偉永興儀器有限公司）。
　　1.2  方法
　　1.2.1  苦皮藤素的提取  參考文獻[2，6]的提取方法，稱取10.00 g苦皮藤根皮粉末，置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL磷酸緩沖液煮沸5 min后過濾，以除去材料中的氧氣。向濾渣中加入酶液，在最適溫度水浴保溫靜置2 h，分別對苦皮藤根皮進行酶解，然后酶失活后過濾，在濾渣中加入甲醇進行提取，60 ℃提取6 h，浸提3次，過濾收集濾液，蒸發器處理濾液，稱苦皮藤素質量。
　　1.2.2  酶的篩選  在提取所得的濾渣中加入100 mL磷酸緩沖液，按照表1加入酶液，用0.1 mol/L鹽酸溶液和0.1 mol/L氫氧化鈉調節pH，在最適溫度水浴靜置2 h，分別對苦皮藤根皮進行酶解、提取，選擇得率最高的酶用于后續試驗。
　　1.2.3  酶法輔助提取單因素試驗  以苦皮藤素得率作為評價指標，分別對酶解pH（1、2、3、4、5）、酶解時間（2、3、4、5、6 h）、酶解溫度（27、37、47、57、67 ℃）和加酶量（22 000、44 000、66 000、88 000、120 000 U/g）進行單因素試驗，以確定各因素的影響效果和最適范圍。
　　1.2.4  酶法輔助提取正交試驗  在單因素試驗基礎上，以酶解溫度、酶解時間、酶解pH、加酶量作為考察因素，以苦皮藤素得率為考察指標，通過4因素3水平正交試驗（表2），進一步優化提取工藝參數。 　　1.2.5  苦皮藤素得率計算  將干燥后的苦皮藤素稱質量，計算得率，苦皮藤素得率（%）=苦皮藤素（g）/苦皮藤根皮樣品的質量（g）×100。
　　2  結果與分析
　　2.1  酶種類的選擇
　　在4種酶中，胃蛋白酶和堿性蛋白酶對苦皮藤素有較好的輔助提取效果，苦皮藤素得率分別為4.5%和4.2%，中性蛋白酶和纖維素酶輔助提取效果較差，得率分別為3.25%和3.16%（圖1），因此，選定胃蛋白酶為苦皮藤素輔助提取所用酶。
　　
　　2.2  單因素試驗結果
　　2.2.1  酶解pH對提取效果的影響  在酶解溫度37 ℃、加酶量22 000 U/g、酶解2 h條件下，不同pH所得苦皮藤素得率結果見圖2，pH 2對輔助提取苦皮藤素有較好的效果。
　　
　　2.2.2  酶解溫度對提取效果的影響  在酶解2 h、加酶量22 000 U/g、pH 2條件下，不同酶解溫度所得苦皮藤素得率結果見圖3，37 ℃對輔助提取苦皮藤素有較好的效果。
　　2.2.3  酶解時間對提取效果的影響  在酶解溫度37 ℃、加酶量22 000 U/g、pH 2條件下，不同酶解時間所得苦皮藤素得率結果見圖4，酶解5 h對輔助提取苦皮藤素有較好的效果。
　　
　　2.2.4  加酶量對提取效果的影響  在酶解溫度為37 ℃、時間2 h、pH 2條件下，不同加酶量所得苦皮藤素得率結果見圖5，加酶量44 000 U/g對輔助提取苦皮藤素有較好的效果。
　　
　　2.3  正交試驗結果
　　以單因素試驗結果為基礎，采用正交試驗優化胃蛋白酶輔助提取苦皮藤素工藝中的酶解時間、酶解溫度、加酶量和pH 4種因素。從表3可知，各因素對酶法輔助提取的影響效果為B>A>C>D，即酶解溫度對提取影響較為明顯，其次是酶解時間、加酶量和pH，試驗最佳組合為A3B2C3D2，即酶解5 h，酶解溫度37 ℃，加酶量為66 000 U/g，酶解pH 2時，酶法輔助提取苦皮藤素得率為5.12%。
　　3  小結與討論
　　在環境越來越受到人們關注的21世紀，對病蟲害治理，人們一直在尋找對人畜無害或低毒的植物源殺蟲劑，可以替代有害殘留的化學藥劑，許多植物次生代謝物質對農業害蟲具有毒殺等生理學功能。較早就以苦皮藤為原料，提取分離出具有殺蟲活性的苦皮藤素[7，8]，后續對其提取及工藝、殺蟲機理等都展開了一系列研究，尤其以吳文君等[9，11]、張繼文等[10]以浸提、層析等分離技術對苦皮藤素化合物展開的研究較為深入，后續也有以回流提取[12]、浸漬提取方法[2]的展開，但酶法輔助提取苦皮藤素的工藝鮮見報道。
　　酶法輔助提取過程中酶解pH、時間、溫度及加酶量對苦皮藤素得率具有影響。通過單因素試驗與正交試驗表明，在酶解5 h，酶解溫度37 ℃，加酶量為66 000 U/g，酶解pH 2時，酶法輔助提取苦皮藤素得率最大為5.12%。雖然酶法輔助提取沒有復雜的操作過程，但酶的成本較高，與傳統回流提取方法[12]并無明顯差異，出現這種可能有多種因素，提取過程中苦皮藤素可能被酶解，酶解pH可能導致苦皮藤素溶解性降低等，因此，探索更加高效的苦皮藤素提取方式將是后續研究的重點。
　　參考文獻：
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