不同粒度的青稞粉中提取β一葡聚糖的工藝研究
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摘要：青稞屬禾本科大麥屬作物，由于它的籽實沒有外殼，所以又稱為裸大麥、米大麥、淮麥及元麥，主要分布在我國青海、西藏、四川的甘孜州、云南的迪慶、甘肅的甘南等地。青稞為海拔4200-4500m高寒地區唯一的農作物，具有高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪、低糖等特點，并富含微量元素、β -葡聚糖等營養成分。其中B-葡聚糖化學名稱為（1-3）（1-4） -β -D-葡聚糖，是一類非淀粉多糖，分為水溶性和水不溶性兩類。近年的研究發現，青稞中B-葡聚糖具有清腸、調節血糖、降低膽固醇、提高免疫力的功能，是對人體健康十分有益的一種可溶性膳食纖維。為合理利用青稞農作物，最大程度提取青稞中的β-葡聚糖，本文通過實驗，采用萬能粉碎機對青稞米進行粉碎，篩選不同目數的青稞粉，提取后通過比較β-葡聚糖的得率和提取量，從而確定最佳粒度。
關鍵詞：青稞;β -葡聚糖;粒度;提取;分光光度法
為合理利用青稞農作物，最大程度提取青稞中的β一葡聚糖，對青稞米粉碎的粒度進行考察，確定最佳粉碎粒度，本文采取了以下實驗方法：采用萬能粉碎機對青稞米進行粉碎，篩選不同目數的青稞粉，提取后通過比較β一葡聚糖的得率和提取量，從而確定最佳粒度。結果表明：粉碎粒度為80目時，青稞β-葡聚糖的提取效果最好。最終得出結論：青稞米最佳粉碎粒度為80目時，能最大程度提取出青稞中的β-葡聚糖。
一、實驗儀器、材料
AB135-S型電子天平（梅特勒一托利多公司）;FS-30B型萬能粉碎機（康華制藥機械有限公司）;藥典篩（浙江上虞市五四紗篩廠）;DZKW-D-I型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）;pH計（梅特勒一托利多儀器上海有限公司）;旋轉蒸發儀（EYELA東京理化器械株式會社）;DZKW-S -8型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）;WH-90A型微型漩渦混合器（上海振榮科學儀器有限公司）;TU-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用有限公司）;15mL離心管、12mL比色管、移液槍（200μL和5mL）;青稞米（青海）;β-葡聚糖標準品（SIGMA公司，純度>95%）;混聯β-葡聚糖檢測試劑盒（Megazyme公司產品，貨號K-BGLU）;超純水：公司超純水系統生產;二水磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、乙醇、檸檬酸均為分析純。
二、青稞原料中
β一葡聚糖含量檢測方法學研究
試劑盒使用相關說明。Megazyme的β-葡聚糖測定試劑
盒可進行100次的測定試驗，該試劑盒包含完整的測定方法及以下試劑，
瓶1：苔蘚酶懸浮液（1mL，4℃條件下可保存3年以上），使用時用20mL的20mmol/L pH6.5磷酸緩沖溶液稀釋瓶1中全部物質，可用聚丙烯管分裝合適大小的幾份后于-20℃條件下貯存，在取出使用期間需保持苔蘚酶低溫，在-20℃條件下可穩定保存兩年以上。
瓶2：β一葡聚糖苷酶懸浮液（1mL，4℃條件下可保存3年以上），使用時用20mL的50mmol/L pH4.0的乙酸鈉緩沖溶液稀釋瓶2中全部物質，用聚丙烯管分裝合適大小的幾份后于-20℃條件下貯存，取出使用期間需保持苔蘚酶低溫，在-20℃條件下可穩定保存兩年以上。注意：不要讓苔蘚酶和β -葡聚糖苷酶交叉污染。
瓶3：GOPOD試劑緩沖溶液（48mL，pH7.4，對羥基苯甲酸和0.4 %W/V疊氮化鈉，4℃條件下可保存4年以上），使用時用IL蒸餾水稀釋瓶3中全部的物質，立即使用。
瓶4：GOPOD試劑酶（葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、4一氨基安替比林，為凍干粉，-20℃條件下可保存5年以上），使用時瓶3稀釋后的1L溶液分次溶解瓶4中所有的物質，轉移至試劑瓶，即為葡萄糖決定試劑GOPOD.用鋁箔避光保存。在2-5℃條件下可穩定保存3個月，在-20℃條件下可穩定保存一年以上。
瓶5：D-葡萄糖標準溶液（5mL，1.Omg/mL，含0.2%的苯甲酸），在室溫條件下可穩定保存五年以上。
瓶6：標準大麥樣品，β一葡聚糖含量見小瓶上的標簽，在室溫條件下可穩定保存五年以上。
瓶7：標準燕麥樣品，β一葡聚糖含量見小瓶上的標簽，在室溫條件下可穩定保存五年以上。
緩沖溶液的配制。磷酸緩沖溶液（ 20mmol/L，pH6.5）：溶解3.12g的二水磷酸二氫鈉（NaH2P04‘2H20）到900mL的蒸餾水中，用lOOmmol/L的NaOH （4g/L）調節pH至6.5（加入約50mL能夠達到要求），再加入蒸餾水配成IL的緩沖溶液。加入0.2g的疊氮化鈉在4℃條件下可穩定保存2個月。
醋酸鈉緩沖溶液（ 50mmol/L，pH4.0）：加入2.9mL的冰醋酸到900mL的蒸餾水中，用Imol/L的NaOH調節其pH到4.O，再用蒸餾水配成IL的緩沖溶液。加入0.2g的疊氮化鈉在4℃條件下可穩定保存2個月。
醋酸鈉緩沖溶液（200mmol/L，pH4.O）：加入11.6mL的冰醋酸到900mL的蒸餾水中，用Imol/L的NaOH調節其pH至4.0，再加入蒸餾水配成IL的緩沖溶液。加入0.2g的疊氮化鈉在4℃條件下可穩定保存2個月。注意：調節pH之前一定不能加疊氮化鈉！酸性條件下疊氮化鈉會放出毒氣。
檢測步驟。1.準確稱取適量樣品加入到15mL離心管中，確保全部樣品都落到離心管底部。2.加入0.2mL的乙醇溶液（ 50%，v/v）于離心管底部，旋渦混合器混勻，以輔助樣品分散;再加入磷酸鈉緩沖溶液（4.OmL，20mmol/L，pH6.5），用旋渦混合器把溶液混合均勻。3.混勻后，立即將離心管置于沸水浴中保溫60秒;取出用旋渦混合器混合均勻后再放到100℃沸水浴中保溫2分鐘，并且再次混勻。4.在50℃的水浴中保溫平衡5分鐘。5.加入苔蘚酶（0.2mL，IOU）并且振搖，密封離心管并且在50℃的水浴中保溫1小時，保溫期間在旋渦混合器上劇烈振蕩3-4次。6.加入醋酸鈉緩沖溶液（5.OmL，200mmol/L，pH4.0）并用旋渦混合器充分混合。7.待離心管冷卻至室溫（約需5分鐘），離心分離（3000r/min，10分鐘），小心準確地移取上清液0.1mL到三支試管的底部（12mL）。8.加入用50mmol/L醋酸鈉緩沖溶液（pH4.O）配制的β -葡聚糖苷酶（O.lmL，0.2U）到其中的兩個試管中（反應管），第三個試管中直接加入醋酸鈉緩沖溶液（空白管），將所有的試管在50℃條件下保溫10分鐘。9.加入GOPOD試劑（3.OmL）到每一個試管，在50℃條件下進一步保溫20分鐘。10.在5lOnm處測定試管中的溶液吸光度值，在一個小時以內完成測定。11.每次實驗必須設定空白對照和50μg/0.1ml或lOOμg/0. Iml葡萄糖標準，設定重復管?？瞻讓φ瞻ǎ?. ImL蒸餾水+O. ImL醋酸鈉緩沖溶液+3.OmL GOPOD試劑。葡萄糖標準包括：0.1mL醋酸鈉緩沖溶液+O.lmL D-葡萄糖標準（lOOμg/O.lmL）+3.OmLGOPOD試劑。12.每次測定必須包括一個標準大麥樣品。 精密度試驗。稱取適量青稞原料粉末（過三號藥典篩）以1.2.3方法處理并顯色后，5lOnm重復測量6次，讀取吸光度，計算RSD值為0.02%，相關數據見表1。
穩定性試驗。用精密度試驗樣品在顯色完成后分別過0、10、20、30、40、50、60分鐘于5lOnm測定吸光度，計算吸光度的RSD值為0.17%，相關數據見表2。
重復性試驗。稱取青稞原料粉末（過三號藥典篩）約80mg于15mL離心管底部，精密稱定6份，按照1.2.3檢測步驟處理樣品并顯色后于紫外可見分光光度計上5lOnm測定吸光度，計算得到該青稞原料β -葡聚糖平均含量為5.5553%，重復性試驗的RSD值為1.26%，相關數據見表3。
加標回收試驗。精密稱取1.2.6重復性試驗中取樣量一半的青稞原料粉末，分別加入各自β一葡聚糖含量80%、100%、120%三個梯度的β一葡聚糖對照品各3份，按照1.2.3檢測方法處理顯色后于5lOnm讀取吸光度，根據檢測數據計算該方法檢測青稞原料中β一葡聚糖含量的平均回收率97.28%，加標回收試驗的RSD值為2.17%，相關數據見表4。
試驗結論。精密度試驗中青稞原料的RSD值為0.02%，表明檢測結果的隨機誤差較小。穩定性試驗青稞原料的RSD值為0.17%，表明該檢測方法顯色后在1小時內穩定性良好。該青稞原料中β-葡聚糖平均含量為5.5 553%，重復性試驗的RSD值為1 .26%，表明檢測結果重復性良好。青稞原料中β-葡聚糖對照品的回收率為94.37%-100.43%，平均值為97.28%，RSD值為2. 17%，表明該檢測方法檢測青稞原料及青稞提取物中β一葡聚糖含量準確可靠。
三、實驗方法
青稞米的粉碎。將青稞米用萬能粉碎機進行粉碎，通過不同目數編號（1—9號）的藥典篩進行過篩處理，收集不同目數的青稞粉，備用。
青稞粉的提取。藥材量：20g。提取條件：15倍量水，用濃鹽酸調節ph至5，水浴鍋加熱至60℃下進行提取1次，2小時/次。過濾：用濾紙趁熱過濾，收集濾液。濃縮干燥：65℃下減壓濃縮青稞提取液，制備青稞提取物，稱其重量，計算得率。檢測：按照1.2中Megazyme公司混聯β-葡聚糖檢測試劑盒方法檢測青稞提取物中β -葡聚糖的含量。
實驗結果。不同編號對應的藥典篩篩網目數得到的青稞粉，提取后得到的青稞提取物質量以及β-葡聚糖的含量結果如下表5。從表中可以看出粒度為80目時，青稞β-葡聚糖的提取量最大，β -葡聚糖的含量也最高。
實驗討論。不同粉碎粒度的青稞粉進行提取時，粉末越細，可提取出來的β -葡聚糖越多，但也并不是越細越好。因為粉末越細，提取時容易成糊糊狀，提取并不能完全。以青稞β-葡聚糖最大提取量和最高含量為結果進行比較，確定青稞米的最佳粉碎粒度為80目。
四、結論
從實驗結果來看，青稞米的最佳粉碎粒度為80目時，青稞β -葡聚糖的提取效果最好，提取量最大，其含量也最高。
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