金葉龜甲冬青組培快繁技術的研究

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　　摘要：以金葉龜甲冬青（Ilex crenata）幼嫩莖段為外植體，設置不同的腋芽誘導培養基、增殖培養基、壯苗及生根培養基進行對比研究，建立金葉龜甲冬青組培快繁體系。結果表明，采用培養基MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L進行初代培養，腋芽誘導率達95%左右;利用培養基MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，叢生芽增殖系數高，幼苗生長健壯且色澤深綠;叢生芽接種于MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L培養基進行壯苗培養，幼苗高度可達4.9 cm，生長健壯，色澤深綠;適宜的生根培養基配方1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭3.0 g/L，生根率100%，根系生長健壯，色澤白色;經生根的試管苗移栽于園土（V）∶蛭石（V）∶泥炭（V）=2∶1∶1混合基質，加以合理管理，成活率可達95%。
　　關鍵詞：金葉龜甲冬青（Ilex crenata）;組培快繁;誘導率;生根率
　　中圖分類號：S687         文獻標識碼：A
　　文章編號：0439-8114（2019）04-0093-05
　　Abstract： To establish an efficient tissue culture system for rapidly propagating， taking young stem section of Ilex crenata ender as explant， different bud-induction medium， proliferation medium， robust seedling medium and rooting medium were conducted. The results showed that the optimal bud-induction medium was MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L and the induction rate of axillary bud was about 95%; The optimal medium for proliferation was MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，multiplication coefficient was high， seedling growth was strong with thick green; The optimal robust seedling medium was MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+sugar 30 g/L， the height of seedling reached 4.9 cm; The optimal rooting medium was 1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+active-carbon 3.0 g/L， and the roots were strong and white in color， the rooting rate was 100%; The survival percentage of plantlets could be up to 95% through transplanted in the substrate containing garden soil， vermiculite and peat （2∶1∶1，V/V/V）.
　　Key words： Ilex crenata; tissue culture and rapid propagation; induction rate; rooting rate
　　金葉龜甲冬青（Ilex crenata）是冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬彩葉植物，具有常綠、耐低溫、植株低矮、緊湊等特點，其老葉色澤濃綠且具光澤，新葉葉色金黃，色澤亮麗。近年來，國內外綠化產業對金葉龜甲冬青的需求旺盛，因此應加快其繁殖速度，滿足其日益增加的市場需求。金葉龜甲冬青的常規繁殖方法有扦插繁殖和嫁接繁殖，但繁殖速度較慢。組培繁殖可以提高金葉龜甲冬青的繁殖系數，加快推廣應用速度，對豐富中國彩葉綠化樹種有重要意義。
　　目前，國內外已有關于金葉龜甲冬青組織培養的部分報道[1-5]，但鮮見細胞分裂素ZT和6-BA對比分析、不同蔗糖濃度對試管苗的影響及添加活性炭對生根培養的影響等方面的研究。本研究從金葉龜甲冬青的外植體消毒、初代培養、增殖培養、壯苗培養、生根培養、煉苗移栽等幾方面著手，以細胞分裂素ZT和6-BA的對比分析、蔗糖濃度對試管苗的影響及活性炭的添加對生根的影響等方面進行研究，以期為金葉龜甲冬青優質種苗的快速繁殖提供技術支持。
　　1  材料與方法
　　1.1  材料
　　供試的金葉龜甲冬青材料由江蘇綠苑園林建設有限公司苗木基地提供。
　　選擇生長兩年的健壯植株，再選擇當年生帶有腋芽的幼嫩莖段（長約2 cm）為外植體。
　　1.2  消毒滅菌
　　將外植體置于流水下沖洗1 h，加入適量的洗滌劑浸泡清洗3次，邊浸泡邊振蕩，沖洗干凈后移至超凈工作臺進行下一步的消毒滅菌。具體操作為：先用75%乙醇浸泡20 s，用無菌水沖洗3次;轉入0.1% HgCl2消毒8～9 min，無菌水沖洗3～5次后，用滅菌紙將外植體表面的水分吸干，接種于初代培養基上。
　　1.3  接種培養
　　1.3.1  初代培養  將經過消毒滅菌的金葉龜甲冬青外植體接種于初代培養基上，各培養基配方均在MS培養基中添加不同種類和不同濃度的植物生長調節劑，同時添加7.0 g/L瓊脂和25 g/L蔗糖，pH 5.6～5.8。每個配方接種24瓶，每瓶接種4個外植體。培養條件為：溫度（20±2） ℃、光照強度1 000～1 500 lx、光照時間10～12 h/d。定期觀察記錄腋芽萌動情況，腋芽誘導率=（誘導出芽苗的腋芽數/外植體上總腋芽數）×100%。 　　1.3.2  增殖培養  選用優化的初代培養基進行初代培養后，將初代培養得到的芽苗切成帶一個腋芽的長0.5 cm的莖段，接種在增殖培養基上，各培養基配方均是在MS培養基中添加不同種類和不同濃度的植物生長調節劑，同時添加7.0 g/L瓊脂和25 g/L蔗糖，pH 5.6～5.8。每個配方接種24瓶，每瓶接種3個莖段。培養條件為：溫度（25±2） ℃、光照強度1 500～2 000 lx、光照時間12～14 h/d。定期觀察記錄叢生芽苗生長情況，計算增殖系數。增殖系數=增殖叢生芽總數/接種數。
　　1.3.3  壯苗培養  選用優化的增殖培養基進行增殖培養后，將產生的叢生芽切下后接種于壯苗培養基上，各培養基配方均在MS培養基中添加不同種類和濃度的植物生長調節劑及不同濃度的蔗糖，同時添加7.0 g/L瓊脂，pH 5.6～5.8。每個配方接種21瓶，每瓶接種3個小苗。培養條件同增殖培養。
　　1.3.4  生根培養  當金葉龜甲冬青無根苗長至3～4 cm時，轉移到生根培養基上培養，各培養基配方均在1/2MS培養基中添加不同種類和濃度的植物生長調節劑及不同濃度的活性炭，同時添加7.0 g/L瓊脂、20 g/L蔗糖，pH 5.6～5.8。每個配方接種21瓶，每瓶接種3個小苗。培養條件同增殖培養。
　　2  結果與分析
　　2.1  初代培養對金葉龜甲冬青的影響
　　由表1可知，不同的初代培養基對金葉龜甲冬青腋芽的誘導產生不同的影響。細胞分裂素ZT對腋芽的誘導有明顯影響，濃度過低時，腋芽誘導率較低，僅為38.5%;ZT濃度為0.5和1.0 mg/L時腋芽誘導率較高，分別為96.2%和94.5%，且誘導出的芽苗高度較高，分別為2.0和2.2 cm;當ZT濃度過高時，腋芽誘導率明顯降低，芽苗高度亦明顯降低。細胞分裂素6-BA對金葉龜甲冬青腋芽誘導有一定的影響，但誘導效果稍差于ZT，初代培養基6-BA濃度為0.5和1.0 mg/L時腋芽誘導率分別為76.6%和84.5%。根據不同的初代培養基對金葉龜甲冬青腋芽誘導的情況，初步判斷，在同種濃度下ZT促進腋芽誘導的活性較6-BA高;適宜的ZT濃度利于金葉龜甲冬青腋芽的誘導，濃度過高或過低均不利于腋芽的誘導。本研究表明，金葉龜甲冬青適宜的初代培養基配方為MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，外植體在初代培養基上培養7～10 d，腋芽開始萌動，50 d后芽苗高度約2 cm。通過初代培養，腋芽誘導率達95%左右。
　　2.2  增殖培養對金葉龜甲冬青的影響
　　接種的莖段在增殖培養基上培養至10 d左右時有叢生芽長出，培養至40 d時觀察記錄叢生芽生長情況，發現不同培養基對金葉龜甲冬青的影響亦有所不同（表2）。其中，配方2的叢生芽增殖系數最高，達2.6，明顯高于其他配方，叢生芽生長健壯，且色澤深綠。叢生芽增殖系數和高度位于其次的是配方1，叢生芽生長一般，色澤淡綠。配方3的叢生芽高度較高（1.2 cm），但增殖系數低，且叢生芽生長細弱，黃綠色。因此，適宜金葉龜甲冬青增殖培養的培養基配方為MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。叢生芽苗通過反復切割，每25～35 d將長出的叢生芽苗切下，繼續繼代培養1次，繼代培養3次后，進行壯苗培養。
　　2.3  壯苗培養對金葉龜甲冬青的影響
　　選用優化的培養基進行繼代培養后，將繼代培養基上的叢生芽苗切下后接種于壯苗培養基上，由表3可知，叢生芽苗接種于不同的壯苗培養基上其表現有所不同。在同樣的蔗糖濃度下，配方1、配方4和配方7相比較，配方4的幼苗生長良好;配方2、配方5和配方8相比較，配方5的幼苗生長良好;配方3、配方6和配方9相比較，配方6的幼苗生長良好。根據此初步判斷，在蔗糖濃度不變的情況下，生長調節劑的濃度比例以ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L為宜。在同樣的生長調節劑濃度比例下，配方1、配方2和配方3相比較，三者的幼苗生長狀況均較差，且差異不明顯;配方4、配方5和配方6相比較，配方4和配方5的幼苗高度差異不明顯，但配方4的幼苗健壯度和色澤均明顯差于配方5，配方6的幼苗高度明顯低于配方5，且幼苗生長一般、色澤黃綠;配方7、配方8和配方9相比較，三者的幼苗生長狀況均較差，且差異不明顯。據此可初步判斷，在同樣的生長調節劑濃度比例下，蔗糖濃度以30 g/L為宜。綜合在同樣的蔗糖濃度和同樣的生長調節劑濃度比例下各壯苗培養基配方幼苗的高度、健壯度和色澤等生長情況，適宜金葉龜甲冬青壯苗培養的培養基配方為MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，幼苗高度可達4.9 cm，生長健壯，色澤深綠。
　　2.4  生根培養對金葉龜甲冬青的影響
　　選用優化的壯苗培養基進行培養20～30 d后，把健壯的金葉龜甲冬青無根幼苗轉移至生根培養基上進行培養，由表4可知，叢無根幼苗接種于不同的生根培養基上其表現有所不同。
　　15 d時統計生根率，不同的生根培養基其生根率不同，其中配方1、配方2和配方3的生根率均較高，三者差異不明顯，配方2的生根率最高，達100%;配方4、配方5和配方6的生根率均較低，明顯低于前3個配方。據此初步判斷，金葉龜甲冬青的生根培養基中選用生長調節劑IBA和NAA合理配比時生根率較高，而選用生長調節劑IAA和NAA合理配比時生根率均較低，故金葉龜甲冬青的生根培養基應添加合理配比的生長調節劑IBA和NAA。
　　金葉龜甲冬青無根幼苗經生根培養基培養40～50 d后，觀察記錄根系生長狀況，包括根系數量、根系長度、健壯度和色澤等指標。因配方4、配方5和配方6的生根率較低，這里僅對前3個配方的根系生長狀況進行分析。配方1、配方2和配方3三者的根系數量差異不明顯，其中配方2的根系數量最多、根系長度最長、且生長健壯、色澤為健康的白色;配方1和配方3的根系長度明顯低于配方2，且這兩個配方的根系生長一般或細弱、色澤呈現為不健康的淡黃色或黃褐色。據此可判斷，金葉龜甲冬青的生根培養基中應添加適宜濃度的活性炭，活性炭濃度以3.0 g/L為宜，過高和過低均不利于根系的生長。綜上所述，金葉龜甲冬青適宜的生根培養基配方為1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭3.0 g/L，生根率100%，根系數量為5.4條/株，根系生長良好，長度3.6 cm、生長健壯，色澤為白色。 　　2.5  煉苗及移栽
　　金葉龜甲冬青在生根培養基中培養40～50 d后可進行煉苗移栽。金葉龜甲冬青組培苗煉苗可先在（23±2） ℃的溫室內擰松瓶蓋放置3～5 d，然后進行溫床過渡移栽。過渡苗床（即溫床）可建在普通單體的塑料大棚內，床寬1.2 m左右，床四周砌高30 cm，床底整平，栽培基質用園土（V）∶蛭石（V）∶泥炭（V）=2∶1∶1，栽培基質須經過滅菌，充分混勻后使用。移栽時，將幼苗從瓶內取出，用清水將金葉龜甲冬青組培苗根部的固體培養基清洗干凈，同時應盡量減少傷根。種入苗床后，選擇清潔水澆灌，并噴施稀釋800～1 000倍的甲基托布津或稀釋1 000倍多菌靈藥液，以后每隔1周噴施1次，連續3～4次。移栽初期要特別注意保持苗床和空氣濕度，濕度保持在90%左右，溫度（23±2） ℃，前期應進行遮陰7～10 d;一般需全封閉管理7 d左右，根據情況在20 d左右可以逐步通風，并除去覆蓋物。一般成活率可達95%。
　　3  小結與討論
　　3.1  細胞分裂素對金葉龜甲冬青腋芽誘導的影響
　　不同的細胞分裂素對植物組培快繁的效果有所不同。張楠等[6]通過對大果黑果枸杞進行初代培養，發現ZT的培養效果明顯優于6-BA，前者的腋芽萌芽率明顯高于后者。劉曉娜等[7]對上西早生甜柿的快繁技術進行了研究，認為ZT 110 mg/L的快繁效果明顯好于6-BA 510 mg/L。孟志霞等[8]研究表明，BA和ZT對金線蓮增殖的作用差異較大，6-BA對金線蓮芽苗增殖作用較ZT強。Jin等[9]認為，與ZT相比，6-BA是較適合藍靛果組培的細胞分裂素。程廣有等[10]研究ZT、6-BA對苦參組培快繁的影響，認為2種細胞分裂素誘導芽增殖時差異不顯著。本研究與張楠等[6]、劉曉娜等[7]的研究結果相似，認為同種濃度下ZT促進金葉龜甲冬青腋芽誘導的活性較6-BA高。用細胞分裂素ZT來誘導金葉龜甲冬青腋芽，濃度應適當，且應與生長素NAA配合使用，ZT濃度過高或過低均不利于腋芽的誘導，金葉龜甲冬青適宜的腋芽誘導培養基為MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，腋芽誘導率達95%左右。
　　3.2  蔗糖對金葉龜甲冬青壯苗培養的影響
　　不同的蔗糖濃度對植物組培快繁產生不同的影響。閆斌等[11]認為NAA與蔗糖的含量對組培苗的壯苗生根具有顯著影響，0.1 mg/L NAA與20 g/L蔗糖有利于組培苗的壯苗生根;蔗糖為30 g/L時，組培苗出現葉片卷曲，葉片較小。李云海等[12]研究表明，在有生長素存在的條件下，調整蔗糖的用量（品種ZH，20 g/L;品種BY-14，40 g/L），馬鈴薯壯苗效果更好，表現在促進根系發育和增加莖葉干物質的含量方面;蔗糖濃度過高，造成培養苗老化，不利于試管苗的快速生長和繁殖。魏梅娟等[13]證明了隨著蔗糖濃度的增加，鐵皮石斛原球莖增殖速度加快，當蔗糖30 g/L時原球莖生長狀態最好，而當蔗糖濃度達40 g/L時，原球莖的生長受到抑制。本研究得出了與此一致的結論，發現在細胞分裂素和生長素適宜配比下（ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L），蔗糖應控制在適宜的濃度，蔗糖濃度過低或過高均不利于金葉龜甲冬青組培幼苗生長，金葉龜甲冬青壯苗培養時蔗糖適宜的濃度為30 g/L，低濃度蔗糖抑制試管苗生長，可能與提供的碳水化合物不足有關[12]，而高濃度的蔗糖使試管苗生長受到抑制可能與高濃度蔗糖產生較高的滲透壓有關[13]。本研究認為適宜金葉龜甲冬青壯苗培養的培養基配方為MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，幼苗高度達4.9 cm，生長健壯、色澤深綠。
　　3.3  生長素和活性炭對金葉龜甲冬青生根培養的影響
　　生長素種類及其濃度對金葉龜甲冬青生根極為重要，生根培養時應選用合適種類和濃度的生長素。梁慧敏等[3]研究表明日本龜甲冬青生根培養基用1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.1 mg/L，生根率達100%。史云光等[5]篩選出金葉龜甲冬青生根的最佳培養基為1/2 MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 0.75 mg/L，培養出的根系均勻、色白。李登中[4]認為金葉日本冬青適宜的生根培養基為1/2 MS+NAA 0.6 mg/L，生根率達95%。朱志國[14]研究表明金葉日本冬青的再生植株在培養基1/2 MS+NAA 0.3 mg/L中不定根誘導效果較好。本研究與梁慧敏等[3]、史云光等[5]的結果有一定的相似之處，認為金葉龜甲冬青試管苗生根培養時應添加NAA和IBA兩種生長素，且二者比例和濃度適當時試管苗生根率較高，而選用生長素IAA和NAA合理配比時生根率均較低，生長素適宜的濃度配比為NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L。
　　活性炭是組培苗生根時常用的一種附加物。不同的活性炭濃度對組培苗誘導生根的效果不同，因此選擇適宜的活性炭濃度顯得非常重要，濃度過高有抑制作用，濃度過低無效果。金香花等[15]認為樹莓試管苗生根培養加入活性炭1.0 g/L，根多、根系健壯，活性碳濃度增加至2.0 g/L時對根系生長不利。陳雄偉等[16]研究表明添加3.0 mg/L活性炭明顯提高鼎湖山紫背天葵生根質量。張素勤等[17]研究了活性炭對非洲菊不定芽生根誘導的影響，表明0.2%～0.3%活性炭能明顯促進生根，縮短生根時間，增加了根數和根長。本研究與陳雄偉等[16]、張素勤等[17]的研究基本一致，表明在適宜的生長素配比（NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L）下，添加3.0 g/L活性炭生根率高，根系白色、且生長健壯;過高或過低均不利于根系的萌發和根系的生長?；钚蕴看龠M試管苗生根的原因可能是活性炭為根的生長發育營造了近似自然生長條件的黑暗環境，同時吸附培養基中有毒副作用的物質，降低鹽離子濃度等[17]。 　　研究了金葉龜甲冬青組培快繁體系的建立，在腋芽誘導階段對比了細胞分裂素ZT與6-BA的效果，認為ZT的效果優于6-BA;適宜的蔗糖濃度（30 g/L）利于金葉龜甲冬青壯苗培養;添加適宜濃度的活性炭（3.0 g/L）可以明顯提高金葉龜甲冬青生根率、根系生長健壯。與扦插繁殖和嫁接繁殖等常規繁殖方法相比，本研究發現優化的金葉龜甲冬青組培繁殖方法：腋芽誘導培養基采用MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，用培養基MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L進行增殖培養，叢生芽在MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L培養基中進行壯苗培養，在1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭3.0 g/L上生根培養，可以將其繁殖系數提高4～6倍，繁殖周期縮短至200～230 d，成活率可達95%。
　　參考文獻：
　　[1] 朱志國.金葉日本冬青組培增殖技術研究[J].安徽科技學院學報，2011，25（6）：39-43.
　　[2] 朱志國.金葉日本冬青愈傷組織誘導及分化的研究[J].安徽農業科學，2007，35（9）：2569-2570.
　　[3] 梁慧敏，夏  陽.日本龜甲冬青莖段再生快繁體系的建立[J].江蘇農業科學，2011，39（5）：65-66.
　　[4] 李登中.金葉日本冬青的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊，2004，40（5）：592.
　　[5] 史云光，朱  艷，徐招娣.金葉龜甲冬青袋式組培應用效果試驗初報[J].江蘇林業科技，2010，37（3）：19-21.
　　[6] 張  楠，曹后男，宗成文，等.大果黑果枸杞組培快繁技術體系的研究[J].遼寧林業科技，2016（1）：22-24.
　　[7] 劉曉娜，馬俊蓮，張子德，等.上西早生甜柿離體快繁技術研究[J].河北農業大學學報，2004，27（1）：61-63.
　　[8] 孟志霞，郭順星，于雪梅，等.植物生長調節劑對福建金線蓮叢生芽增殖的影響[J].中國藥學雜志，2008，43（23）：1777-1780.
　　[9] JIN C，CAO H N，ZONG C W，et al. Research on tissue culture and rapid propagation technology of superior individuals of Lonicera edulis Turcz[J].Agricultural Science & Technology，2011，12（11）：1585-1588.
　　[10] 程廣有，唐曉杰.苦參組培快繁技術體系的初步研究[J].西北植物學報，2007，27（5）：1026-1029.
　　[11] 閆  斌，潘超美，何  潔，等.穿心蓮組培苗的壯苗生根與移栽基質研究[J].時珍國醫國藥，2016，27（7）：1730-1732.
　　[12] 李云海，陳麗華，陶仁艷，等.馬鈴薯試管苗壯苗培養基的篩選[J].現代農業科技，2012（22）：65-66.
　　[13] 魏梅娟，李  雪，葉清梅，等.鐵皮石斛組培苗生長的影響因素研究[J].北方園藝，2011（2）：146-148.
　　[14] 朱志國.金葉日本冬青組織培養研究[D].南京：南京農業大學，2006.
　　[15] 金香花，郎賢波，李美蘭，等.活性炭、MS濃度及生長素對樹莓試管苗生根及生長的影響[J].延邊大學農學學報，2015，1（37）：31-34.
　　[16] 陳雄偉，邵  玲，梁  廉，等.活性炭對鼎湖山紫背天葵組培苗生根的影響[J].中藥材，2012（9）：1369-1373.
　　[17] 張素勤，鄒志榮，耿廣東，等.活性炭對非洲菊組培苗的生根誘導和移栽基質的篩選[J].北方園藝，2008，31（5）：207-208.
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