凸尖杜鵑組培快繁體系的構建

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　　摘要：通過對凸尖杜鵑（Rhododendron sinogrande Balf. f. et W. W. Sm.）實生苗的啟動與增殖培養，探索適宜凸尖杜鵑的滅菌方法及其啟動與增殖培養基配方，以建立凸尖杜鵑的組織培養體系。結果表明，兩種杜鵑用0.1%的HgCl2滅菌8 min真菌污染率較低，在此處理下凸尖杜鵑和泡泡葉杜鵑（Rhododendron edgeworthii Hook. f.）的真菌污染率分別為5%和10%;當培養基中的吲哚丁酸（IBA）濃度為0.3 mg/L、玉米素（ZT）濃度為0.01 mg/L時，凸尖杜鵑實生苗的啟動率最高，達到80%;當噻苯?。═DZ）的濃度為    6 mg/L時，增殖倍數最高，達到5.32。
　　關鍵詞：凸尖杜鵑（Rhododendron sinogrande Balf. f. et W. W. Sm.）;組織培養;生長素;細胞分裂素
　　中圖分類號：S685.21;Q943.1         文獻標識碼：A
　　文章編號：0439-8114（2019）09-0124-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.030           開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
　　Abstract： Through the initiating and proliferating culture of Rhododendron sinogrande seedling， the sterilization method and media components of initiating and proliferating culture suitable for R. sinogrande were explored to establish the tissue culture system of R. sinogrande. The results showed that， the fungus contamination rate of two kinds of Rhododendron were lower when they were sterilized for eight minutes under 0.1% HgCl2， and the fungus contamination rate for R. sinogrande and R. edgeworthii Hook. f. was 5% and 10%， respectively. The initiation rate of R. sinogrande seeding was the highest for 80%， when the concentration of IBA was 0.3 mg/L and the concentration of ZT was 0.01 mg/L in the medium; The multiple proliferation was the highest for 5.32， when the concentration of TDZ was 6 mg/L in the medium.
　　Key words： Rhododendron sinogrande Balf. f. et W. W. Sm.; tissue culture; auxin; cytokinin
　　凸尖杜鵑（Rhododendron sinogrande Balf. f. et W. W. Sm.）為常綠喬木，屬杜鵑花科杜鵑花屬，原產于云南西部和西北部、西藏東南部，生于海拔    2 100～3 600 m的高山杜鵑林或針葉林中。該物種花型美麗，顏色鮮艷，具有很高的觀賞價值，在盆栽中的應用性也很高。但是，由于它生長于海拔較高的地方，且生長環境特殊，同時受季節和母本材料等的限制，導致目前無法進行大量的商品化生產。
　　杜鵑花屬于中國十大名花之一，深受廣大花卉愛好者的喜愛，但其栽培繁殖存在一定的問題。杜鵑的繁殖方式主要是種子繁殖、扦插繁殖、壓條繁殖、嫁接繁殖等[1]。杜鵑花科植物的多數種在扦插繁殖過程中往往難以生根，并且由于多種因素的影響，杜鵑花科植物扦插即使生根，通常也難以成活[2]。再者，播種、扦插和嫁接等方法比較容易受季節和母株材料的影響，導致杜鵑繁殖系數降低，并且生長周期長，不適宜進行大規模的商業化生產[3]。
　　運用植物組織培養技術繁育觀賞植物，具有繁殖系數高、繁殖速度快、不受季節影響、易于產業化等優點[4]。因為組織培養屬于無性繁殖，后代產生變異的可能性較低，同時，比起常規的扦插、嫁接、種子繁殖等方法，它的繁殖速度成倍增加，且繁殖率很高[5]。目前，國內對杜鵑花的研究主要集中在種子繁殖、扦插繁殖、壓條繁殖、嫁接繁殖以及植物分類學研究等方面，而對其組培快繁體系建立的研究報道較少[6]。杜鵑資源的組織培養只在少數幾個種類上進行過研究[7，8]，而鮮見關于凸尖杜鵑的組織培養研究。為此，試驗通過對凸尖杜鵑組織培養體系的構建，以期為其商品化生產奠定基礎。
　　1  材料與方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  研究對象  以凸尖杜鵑為研究對象，播種后，待實生苗長到1.0～1.5 cm時作為組織培養的外植體。
　　1.1.2  試劑及儀器設備
　　1）試劑。1/4 MS培養基、玉米素（ZT）、吲哚丁酸（IBA）、噻苯?。═DZ）、NaOH溶液、0.1% HgCl2溶液、75%的乙醇、工業乙醇、無菌水。 　　2）儀器設備。超凈工作臺、高壓滅菌鍋、接種操作器具、組培光照培養室。
　　1.2  方法
　　1.2.1  播種  將凸尖杜鵑種子播種于穴盤上，定期澆水。
　　1.2.2  啟動培養
　　1）滅菌方法的篩選。由于不同品種杜鵑的細菌污染率和真菌污染率存在一定差異，為了探索不同品種杜鵑的滅菌效果差異，在啟動培養前先進行滅菌方法的篩選。即將凸尖杜鵑（T）與泡泡葉杜鵑（Rhododendron edgeworthii Hook. f.）（P）分別用處理1（0.1% HgCl2滅菌6 min）和處理2（0.1% HgCl2滅菌8 min）兩種方法滅菌后，接種在不添加激素的1/4 MS培養基上，每處理兩種杜鵑分別接種小苗30株。
　　2）培養基?；九囵B基為1/4 MS培養基，pH 5.4～5.6，121 ℃高壓滅菌30 min[9]。在試驗所用的培養基中分別添加不同濃度的ZT和IBA，采用完全隨機設計，每處理接種小苗30株。具體設計見表1。
　　3）滅菌。選擇1.0～1.5 cm生長狀況良好的凸尖杜鵑實生苗，用洗潔精浸泡處理10 min，然后用清水漂洗，再用流動的自來水沖洗1 h（由于小苗較脆弱，沖洗時可在燒杯上蓋上一層紗布），之后再用75%的乙醇浸泡30 s，然后用無菌水沖洗3～5次。最后用0.1%的HgCl2消毒8 min，無菌水沖洗3～5次。
　　4）接種。超凈工作臺及操作室先紫外燈滅菌30 min，然后在操作臺中將處理好的實生苗分別接種在啟動培養基上。
　　5）培養條件。將接種后的小苗置于組培室中，培養溫度23～28 ℃，光照度1 500～2 000 lx，光照時間12 h/d。
　　1.2.3  增殖培養
　　1）培養基。1/4 MS基本培養基中添加不同濃度的TDZ和IBA，試驗采用完全隨機設計，每處理接種外植體30個。具體設計見表2。
　　2）接種。將啟動培養后小苗的芽切下，分別接種在增殖培養基上。
　　3）培養條件。將接種后的小苗置于組培室中，培養條件與啟動培養相同。
　　1.2.4  數據統計和分析
　　污染率=污染的外植體數/接種外植體數×100%
　　成活率=未污染外植體成活數/未污染外植體總數×100%
　　啟動率=未污染外植體啟動數/未污染外植體總數×100%
　　增殖倍數=增殖后的芽數/接種的外植體數[10]
　　運用SPSS 19.0對數據進行顯著性分析，然后用LSD法進行多重比較[11]。
　　2  結果與分析
　　2.1  滅菌方法的篩選
　　滅菌處理后將杜鵑小苗接種到1/4 MS培養基上，每天觀察并記錄，兩周后統計污染情況。從圖1可以看出，滅菌時間對滅菌效果存在影響。在兩種處理下，兩種杜鵑的真菌污染率存在顯著差異，其中0.1% HgCl2滅菌8 min的杜鵑小苗真菌污染率較低，而細菌污染率與成活率均無顯著差異。綜合得出，0.1% HgCl2滅菌8 min為最佳滅菌方法。
　　2.2  啟動培養結果
　　將凸尖杜鵑小苗接種到啟動培養基上培養，60 d后統計啟動率。不同濃度的吲哚丁酸（IBA）與玉米素（ZT）的組合對凸尖小苗的啟動率有一定影響，9種處理下的啟動率存在明顯差異，其中，最優的激素組合為A1（1/4 MS+0.3 mg/L IBA+0.01 mg/L ZT）（圖2）。
　　2.3  增殖培養結果
　　將接種后的凸尖杜鵑芽苗增殖培養60 d后統計增殖倍數（圖3）。由圖3可以看出，噻苯?。═DZ）的濃度對凸尖杜鵑芽的增殖有影響，在不同濃度下的增殖倍數差異明顯，其中，噻苯?。═DZ）濃度為6.0 mg/L時，增殖效果最好，增殖倍數達到了5.32。
　　3  小結與討論
　　3.1  滅菌方法的篩選
　　凸尖杜鵑植株表面附有絨毛，給組培過程中的滅菌操作帶來了困難，接種后的污染率極高。試驗數據表明，用0.1%的HgCl2滅菌8 min后，組培苗的真菌污染率最小。而在其他文獻中也有相關結論。例如吳福建[5]的研究中就得出過類似結論，即較長時間的次氯酸鈉和短時間的HgCl2配合使用，對杜鵑的毒害較小，但污染率較高，綜合考慮用0.1%的HgCl2處理莖段8 min的消毒效果最好。這與本研究得出的結論相同。但是，陳振光等[12]提出，HgCl2雖然滅菌效果好，卻極易殘留，并且對植物組織和細胞殺傷力較大。綜合以上結論分析，雖然HgCl2對植物的毒害作用較大，但是小苗的再生能力強，因此能夠快速地代謝掉滅菌后剩余的HgCl2，且小苗的莖干尚未木質化，則褐化的可能性較小，因此，凸尖杜鵑小苗的最佳滅菌方法為0.1% HgCl2滅菌8 min。
　　3.2  啟動培養
　　在啟動培養時，本研究選擇的細胞分裂素為ZT，鐘宇等[13]在研究中提出，ZT具有較強的誘導分化作用。陳幼妹[14]的研究中，采用的是改良后的1/4 MS培養基，得出在此培養基下相對較優的激素組合為1/4 MS+ZT 2 mg/L+IAA 0.5 mg/L;何芳蘭[15]也在組培研究中使用了ZT與IBA的組合，得出的最佳啟動組合為ZT 1 mg/L+IBA 0.05 mg/L;不僅如此，黃萍萍[16]在研究中提出誘導率、誘導系數在ZT濃度1～3 mg/L時隨濃度的升高而升高，從而得出，高山杜鵑（蒙他瑰）在1/4 MS培養基上相對較理想的激素組合為ZT 2 mg/L+IAA 0.5 mg/L。而本試驗得出的最佳啟動培養組合為1/4 MS+ZT 0.01 mg/L+IBA 0.3 mg/L。綜上結論便可解釋，雖然在本試驗中啟動率較高，最高達80%，但是叢芽個數較少，可能的原因是試驗激素組合配比適中，適宜植株誘導出芽，但是由于ZT濃度太低，從而導致單個植株的芽個數較少。 　　3.3  增殖培養
　　在進行杜鵑組培時，植物激素一般選擇KT、  6-BA、ZT等，國外使用2-ip、TDZ比較多。范玉清[17]的研究認為，TDZ由于活性較強，是用來培養較頑固的尤其是木本植物的一類較合適的細胞分裂素。因此選擇了噻苯?。═DZ）作為細胞分裂素。在杜鵑的組織培養中，目前也有了相關的研究，苗永美[18]就用TDZ和IBA的組合對大樹杜鵑、桃葉杜鵑的愈傷組織進行增殖，增殖率皆達到100%。苗永美[18]最后得出的增殖培養的最佳激素組合為TDZ 0.4 mg/L+IBA 0.05 mg/L，在此配方下的增殖倍數是3.25。而本試驗得出的最佳增殖配方為1/4 MS+TDZ 6.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L，且隨著TDZ的濃度升高，增殖倍數不斷變大。當TDZ濃度達到6.0 mg/L時，增殖倍數達到5.32。在苗永美[18]的研究中，TDZ與IBA的濃度之比接近10，而本試驗中TDZ與IBA的濃度之比為6，可能因此造成了結果的差異，除此之外，還有可能是因為培養基等的影響。還有相關報道指出，TDZ易產生玻璃化苗，且濃度增大，玻璃化苗發生頻率上升，但在本試驗中尚未出現玻璃化現象。
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　　收稿日期：2019-01-28
　　基金項目：云南省教育廳科學研究基金（2016ZDX115）;大理州環保局橫向項目“蒼山瀕危特有植物繁育和遷地保護實施方案”;云南省教育廳資助項目（2017ZZX027）
　　作者簡介：張信玲（1995-），女（彝族），云南昭通人，2014級本科生，（電話）18887223433（電子信箱）1841474587@qq.com;通信作者，孔令芳（1983-），女，講師，碩士，主要從事園藝植物栽培育種的研究工作，（電話）13658726280（電子信箱）lfk8310@163.com。
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