甘肅省大麥條紋病菌遺傳多樣性及致病力差異

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　　摘要 為了解甘肅省大麥條紋病病原菌Pyrenophora graminea的遺傳多樣性及致病力差異，運用RAPD分子標記技術對大麥條紋病菌不同菌株進行遺傳多樣性分析，并采用三明治法進行菌株致病力差異研究。結果表明：17個RAPD標記從45個菌株中擴增出126條帶，平均每個標記7.41條帶，遺傳相似系數范圍為0.468 3～0.984 1，平均值為0.830 8，當遺傳相似系數為0.723 6時，可將供試菌株劃分為4個類群，分別包含41、2、1和1個菌株;致病力測定結果顯示菌株QWC較菌株QQ致病力強，兩菌株除在品種‘甘啤2號’和‘GP3’上無致病力外，在其他供試品種上致病力均存在差異。表明大麥條紋病菌不同菌株間存在遺傳差異，且菌株QWC和菌株QQ存在致病力差異。
　　關鍵詞 大麥條紋病菌; 隨機擴增多態性DNA; 遺傳多樣性; 致病力差異
　　中圖分類號： S 435.123
　　文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018287
　　Abstract The genetic diversity of Pyrenophora graminea collected from different regions in Gansu， was detected with RAPD markers， and the virulence difference between isolate QQ and isolate QWC was tested by the sandwich method. The results showed that a total of 126 fragments were obtained from 45 isolates. Among them， all of the fragments were polymorphic， with an average of 7.41 fragments per RAPD marker. The genetic similarity ranged from 0.468 3 to 0.984 1， with the average of 0.830 8. Isolates in the study were classified into 4 groups at a genetic similarity level of 0.723 6. Virulence test showed that isolate QWC had higher virulence than isolate QQ， and isolate QWC and isolate QQ had virulence difference on all barley varieties except ‘Ganpi 2’ and ‘GP3’， which were immune to isolate QWC and isolate QQ. The results indicated that there was genetic difference among 45 isolates and a clear virulence differentiation between isolate QWC and isolate QQ.
　　Key words Pyrenophora graminea; RAPD; genetic diversity; virulence differentiation
　　大麥作為全球第四大禾谷類作物，與其他麥類作物相比，其抗旱、耐瘠和耐鹽性更強，在全世界廣泛種植，而我國大麥貿易長期處于凈進口狀態[1]。經過育種工作者多年的努力，目前已經育成部分品種，緩解了我國啤酒大麥市場的供求矛盾。隨著我國人均啤酒消費量的上升、人口的增加以及大麥糧草雙高育種目標的提出，對啤用大麥需求進一步加大，但我國大麥生產和發展過程受到大麥條紋?。╞arley leaf stripe）的影響，該病害是由麥類核腔菌Pyrenophora graminea （anamorph Drechslera graminea）[（Rabenh. ex. Schlech.）Shoemaker]引起的種傳病害，在大多數大麥種植地區發生嚴重，導致大麥嚴重減產[23]。大麥條紋病主要發生在北美、北非、俄羅斯、歐洲、印度和中國等。國內該病害主要分布在沿長江流域的浙江、江蘇、四川、甘肅河西走廊地區以及青藏高原裸大麥區等。近年來大麥條紋病在我國江蘇、浙江、四川和湖北等地的重病區平均發病率高達35.3%[4]，河西走廊玉門市發病率達60%，造成30%～40%的產量損失[5]，甘肅省古浪縣重病田塊發病率達到27%[6]。
　　大麥條紋病菌遺傳多樣性分析國內外已有報道，Jawhar等[7]運用12個隨機引物對來自敘利亞不同地區的大麥條紋病菌進行RAPD分析，結果表明不同菌株間有明顯遺傳差異;王春明等[8]運用10個隨機引物對甘肅省的11個大麥條紋病菌標樣進行RAPD分析，11個供試菌株間遺傳距離為0.02～0.31。Bayraktar等[9]對采自不同地區大麥條紋病菌進行ITSRFLP和ISSR分析，ITSRFLP結果顯示供試菌株間無差異，而ISSR分析顯示供試菌株可劃分為4個簇。司二靜等[10]利用ISSR標記對甘肅省不同地區的大麥條紋病菌進行遺傳多樣性分析，結果表明90.24%的片段具有多態性，遺傳相似系數為0.44～1，當遺傳相似系數為0.68時，可將供試菌株劃分為4個類群。
　　抗病育種是病害防治經濟有效的途徑，抗性評價是抗病育種的前提條件，而不同菌株間致病力差異給抗性評價帶來了很大困擾，只有在明確菌株間致病力差異的基礎上才有可能獲得準確的抗性評價，國內外關于大麥抗條紋病菌致病力差異已有報道，Tekauz[11]評價了3個菌株對57份大麥品種進行抗性評價，結果表明3個菌株在致病力上存在顯著差異，WRS1237致病力最強而WRS1238致病力最弱。Gatti等[12]依據菌絲生長速率、致病力和蛋白類型進行群體變異分析，將供試菌株劃分成無致病力、中等致病力和強致病力，且不同致病力的類群擁有不同的蛋白類型。Bayraktar等[9]在48個大麥品種上對13個菌株進行致病力變異分析，結果顯示菌株存在很高的致病力變異。吳寬然[13]通過對13個菌株的侵染調查分析，發現各個菌株間的致病力差異較大。司二靜等[10]采用三明治法對43個大麥條紋病菌進行致病力差異研究，其中強致病力、中等致病力和弱致病力菌株分別為2個、21個和20個，表明不同菌株間存在明顯致病力差異。目前關于甘肅省大麥條紋病菌在不同品種上的致病力差異研究還未見報道。 　　本研究對來源于甘肅省不同地區、不同年份的大麥條紋病菌運用RAPD標記進行遺傳多樣性分析，并通過三明治法接種不同大麥品種進行菌株間致病力差異研究，以期為深入開展該病害的流行規律和抗病育種提供理論依據。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　供試菌株：45個Pyrenophora graminea菌株由甘肅省干旱生境作物學重點實驗室麥類種質創新課題組提供，菌株詳細信息見表1。
　　1.2 方法
　　1.2.1 45個大麥條紋病菌菌株RAPD分析
　　不同菌株DNA的提取參考改良CTAB法[910，14]。RAPD引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，菌株間表現多態性的引物信息見表2。PCR擴增體系為10 μL：2×Master Mix 5 μL、10 μmoL/L引物1 μL、60 ng/μL模板1 μL，加ddH2O至10 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性3 min;94℃變性30 s;37℃ 退火30s;72℃延伸2 min，共35個循環;72℃延伸10 min，4℃保存，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
　　1.2.2 大麥條紋病菌菌株QWC和QQ的致病力測定
　　致病力測定方法采用三明治法[10，15]，將菌株QWC和QQ分別在PDA培養基上培養7 d，在菌落邊緣打取菌餅，置于新PDA培養基上，在22℃下恒溫培養7 d，用來接種大麥種子。
　　種子用70%乙醇處理30 s，再用5%次氯酸鈉處理5 min，經無菌水沖洗多次后將種子徹底晾干，然后將種子置于生長7 d的兩層菌絲的PDA培養基中間，每個重復接種30粒大麥種子，每個品種3次重復，6℃黑暗放置20 d后轉移至直徑12 cm花盆，L∥D=12 h∥12 h，培養45 d后待病斑完全顯現時進行觀察記載每次重復的全部幼苗數，及出現癥狀的幼苗數。
　　1.3 數據分析
　　將電泳結果DNA圖譜中清晰且可重復的條帶記為“1”，無條帶記為“0”，利用軟件NTSYSpc 2.10e計算各菌株間遺傳相似性系數（genetic similarity，GS），采用UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）法進行聚類分析。
　　致病力劃分參照Bayraktar 等[9]：發病率>70%為強致病力， 20%<發病率≤70%為中等致病力，0<發病率≤20%為弱致病力，發病率=0為無致病力。
　　2 結果與分析
　　2.1 45個大麥條紋病菌菌株RAPD分析
　　17個RAPD引物在45個大麥條紋病菌中共擴增出126條譜帶，平均每個引物擴增出7.41條帶。不同菌株間的遺傳相似系數范圍為0.468 3～0.984 1， 菌株HJX1與LB2的遺傳相似系數最大，表明二者遺傳距離和遺傳差異均最小，菌株LB2與NH1的遺傳相似系數也較大，為0.976 2。菌株ZYM與QZ的遺傳相似系數最小，表明二者遺傳距離和遺傳差異均最大，菌株YPH與QZ的遺傳相似系數也較小，僅為0.484 1。供試菌株遺傳相似系數平均值為0.830 8，表明供試菌株間群體遺傳差異較小，可能是引物數量較少所致，也可能與菌株主要來源于河西地區有關。
　　2.2 聚類分析
　　以UPGMA法對供試的45個菌株構建聚類圖，在遺傳相似系數為0.540 0時，可劃分為2類群，菌株QZ單獨為一類群，剩余菌株構成第二類群; 0.723 6時可將供試菌株劃分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ為4個類群，分別包含41、2、1和1個菌株，其中菌株DQ2和菌株QZ各為一類，菌株HZZ和ZHZH構成一類，而剩余41個菌株劃分為一類（圖1）。本研究中菌株來源于不同地區，通過聚類分析發現采集于同一地區的菌株未被聚在一起，如DQ和DQ2均來源于甘肅玉門東渠同一田塊的不同感病植株，但被劃分在不同類群中，表明菌株DQ和DQ2間存在一定遺傳差異，此外來源于內蒙古的菌株SKL與來源于甘肅永昌的XSB聚在一起，遺傳相似系數較大，因此基于RAPD分析結果表明大麥條紋病菌菌株類群與菌株的地理來源間沒有明顯的相關性。
　　2.3 菌株QWC和QQ的致病力差異
　　將菌株QWC和QQ分別接種于62份不同來源的大麥品種上研究其致病力差異。結果表明，接種菌株QWC的大麥材料的發病率為0～90.12%，接種菌株QQ的發病率為0～66.67%;在62個大麥品種上接種QWC和QQ平均發病率分別為38.28%和10.04%，分別表現為中等致病力和弱致病力，菌株QWC致病力與菌株QQ相比較強。菌株QWC在62個品種上的致病力表現依次為9個品種上表現強致病力、36個品種上表現為中等致病力和11個品種上表現為弱致病力，6個品種上表現為無致病力;菌株QQ對供試62個品種均未表現出強致病力，在12個品種上表現為中等致病力，30個品種上表現為弱致病力，20個品種上表現為無致病力（表3）。QWC和QQ除在品種‘甘啤2號’和‘GP3’上表現為無致病力外，在多數品種上致病力差異較大。在整體水平上雖然菌株QWC比菌株QQ致病力強，但是在個別品種上菌株QQ比菌株QWC致病力強，如在‘BARI193’和‘內08PJ36’上菌株QWC表現為無致病力而菌株QQ表現為中等致病力?；诓煌贩N對供試菌株的反應差異表明菌株QWC和菌株QQ存在明顯的致病力差異。
　　3 討論
　　寄主與病原菌的自身特點及相互關系對抗病育種和病害防治具有非常重要的指導意義，兩者是相互斗爭相互依存關系，而病原菌遺傳多樣性和致病力差異對病害防治尤為重要，本研究通過RAPD方法對不同來源的大麥條紋病菌進行遺傳多樣性分析，并通過人工接種方法對不同菌株進行致病力差異研究。
　　本研究結果顯示RAPD分析可以揭示供試菌株間遺傳差異，與Jawhar等[7] 和王春明等[8]的結果較一致，并且本研究選取的引物數量多于前者，本研究篩選到17條在供試菌株間表現多態性引物，而Jawhar等[7]和王春明等[8]分別只篩選到9條和2條多態性RAPD引物。本試驗RAPD分析結果顯示擴增譜帶在菌株間均表現多態性，與王春明等[8]報道的46.15%相比較高，產生此差異可能與本研究中所用菌株數量較多，且地理來源更加豐富有關。菌株GKM采集于甘肅省甘南青稞感病植株，而聚類結果顯示菌株GKM與來源于甘肅古浪的菌株SSH遺傳差異較小，聚在一起，這與王春明等[8]報道的菌株類群與不同寄主有一定的相關性的研究結論不一致，可能與供試菌株數量有關。本研究結果表明RAPD聚類與河西地區菌株地理來源無相關性，與Bayraktar等[9]的研究結果相一致，造成該現象的原因與大麥條紋病為種傳病害有關，同一地區不同地塊種子來源地不同，不同種植區域間的種子調運對病原菌在不同地理區域間的傳播也起到重要的作用。 　　本研究通過不同品種經人工接種不同菌株后的發病率對不同菌株進行致病力差異研究，結果顯示不同菌株間致病力差異較大，與前人研究結果[10， 13]相一致。司二靜等[10]在大麥品種‘Isotta’上對43株大麥條紋病菌進行致病力測定，其中菌株QWC和菌株QQ分別劃分為強致病力菌株和弱致病力菌株，而本研究選取菌株QWC和菌株QQ在62份大麥上進行致病力測定，結果顯示菌株QWC較菌株QQ致病力強，與司二靜等[10]的研究結果一致。因菌株QWC和菌株QQ存在明顯致病力差異，在部分品種上菌株QWC表現無致病力，但是菌株QQ卻能使該品種致病，如‘BARI193’和‘內08PJ36’。本研究只篩選到品種‘甘啤2號’和‘GP3’對菌株QWC和菌株QQ均表現為抗病，接種后未發現感病植株，后續應考慮通過構建遺傳群體在免疫品種中挖掘抗性基因或QTL，進而更好地為大麥條紋病的抗病育種提供抗性資源。
　　由于本研究中只選用了40條RAPD引物中多態性較高的17條RAPD對供試菌株進行遺傳多樣性分析，若要更加詳細地進行甘肅省大麥條紋菌的遺傳多樣性分析，還需進行大量的RAPD引物篩選或采用其他標記方法進行相關研究。 本研究只選用菌株QWC和菌株QQ在不同大麥品種上進行致病力差異研究，后續應選取更多菌株在不同品種上進行致病力差異研究，通過菌株間遺傳差異和致病力差異為大麥條紋病抗病育種和病原菌致病機理研究提供理論依據。
　　參考文獻
　　[1] 李先德，孫致陸，張京.2014年世界和中國大麥生產與貿易形勢及2015年展望[J].農業展望，2015，11（2）：4347.
　　[2] ARABI M I E， JAWHAR M， ALSAFADI B， et al. Yield responses of barley to leaf stripe （Pyrenophora graminea） under experimental conditions in southern Syria [J]. Journal of Phytopathology， 2004， 152（8/9）： 519523.
　　[3] PORTAPUGLIA A， DELOGU G， VANNACCI G.Pyrenophora graminea on winter barley seed： effect on disease incidence and yield losses[J]. Journal of Phytopathology，1986，117（1）：2633.
　　[4] 陳桂華，褚金云，金保根，等.金山區大麥條紋病暴發情況及原因分析[J].上海農業科技，2009（5）：134.
　　[5] 靳生杰，洪平，張麗瓊.玉門市大麥條紋病的發生與防治[J].農業科技與信息，2008（13）：3536.
　　[6] 司二靜.大麥條紋病病原菌基因組測序及SSR標記開發[D].蘭州：甘肅農業大學，2016.
　　[7] JAWHAR M， SANGWAN R S， ARABI M I E.Identification of Drechslera graminea isolates by cultural characters and RAPD analysis [J].Cereal Research Communications，2000，28（1）：8793.
　　[8] 王春明，鄭果，洪流，等.甘肅省不同地區大麥條紋病病菌致病力測定及RAPD分析[J].中國植保導刊，2014，34（4）：1014.
　　[9] BAYRAKTAR H， AKAN K. Genetic characterization of Pyrenophora graminea isolates and the reactions of some barley cultivars to leaf stripe disease under greenhouse conditions[J]. Turkish Journal of Agriculture and Forestry， 2012， 36（2）： 329339.
　　[10]司二靜，楊淑蓮，李葆春，等.甘肅省大麥條紋病病原菌致病力分化、rDNAITS及遺傳多樣性分析[J].植物保護學報，2017，44（1）：8492.
　　[11]TEKAUZ A. Reaction of Canadian barley cultivars to Pyrenophora graminea， the incitant of leaf stripe [J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 1983， 5（4）： 294301.
　　[12]GATTI A， RIZZA F，DELOGU G， et al. Physiological and biochemical variability[of the barley] in a population of Drechslera graminea[J]. Journal of Genetics & Breeding，1992，46：179186.
　　[13]吳寬然.大麥條紋病菌種群遺傳結構分析及抗性種質鑒定[D].杭州：浙江師范大學，2013.
　　[14]WEILAND J J， STEFFENSON B J， CARTWRIGHT R D， et al. Identification of molecular genetic markers in Pyrenophora teres f. teres associated with low virulence on ‘Harbin’ barley[J]. Phytopathology， 1999， 89（2）： 176181.
　　[15]PECCHIONI N， FACCIOLI P， TOUBIARAHME H， et al. Quantitative resistance to barley leaf stripe （Pyrenophora graminea） is dominated by one major locus[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1996， 93（1/2）： 97101.
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