聊城市倉儲玉米籽粒霉爛病原菌的分離與鑒定

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　　摘要 為了明確聊城市引起倉儲玉米籽粒霉爛的病原菌種類，采用形態學和分子生物學相結合的方法對54份樣本進行了病原菌分離和鑒定。結果表明，優勢病原菌為擬輪枝鐮孢Fusarium verticillioides，其次為哈茨木霉復合種Trichoderma harzianum species complex，分離頻率分別為31.48%和24.07%，其他病原菌如禾谷鐮孢復合種F.graminearum species complex、層出鐮孢F.proliferatum、棘孢木霉T.asperellum、黑曲霉Aspergillus niger、黃曲霉A.flavus、草酸青霉Penicillium oxalicum和玉蜀黍絲核菌Rhizoctonia zeae的分離頻率分別為9.26%、1.85%、1.85%、5.56%、5.56%、14.81%和3.70%?；?1個哈茨木霉復合種分離物的EF1α基因序列進行了系統發育分析，結果表明該地區分離到的均為非洲哈茨木霉T.afroharzianum。致病性測定結果顯示，非洲哈茨木霉是玉米穗腐病的致病菌且對玉米產量有一定影響。
　　關鍵詞 倉儲; 籽粒霉爛; 病原菌; 哈茨木霉
　　中圖分類號： S 432.44
　　文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018238
　　Abstract In order to clarify the pathogens of maize kernel rot during storage in Liaocheng city， the fungi in 54 samples were isolated and identified by a combination of morphological and molecular methods. The results showed that the dominant fungus was Fusarium verticillioides， followed by Trichoderma harzianum species complex （THSC）， which were isolated by 31.48% and 24.07%， respectively. The isolation frequencies of other fungi such as F.graminearum species complex， F.proliferatum， T.asperellum， Aspergillus niger， A.flavus， Penicillium oxalicum and Rhizoctonia zeae were 9.26%， 1.85%， 1.85%， 5.56%， 5.56%， 14.81% and 3.70%， respectively. Phylogenetic analysis based on the EF1α sequences of 11 THSC isolate showed that all isolates in this region were T.afroharzianum. Pathogenicity test revealed that T.afroharzianum was the pathogen of maize ear rot and had some negative effect on corn yield.
　　Key words storage; kernel rot; pathogens; Trichoderma harzianum
　　玉米是三大糧食作物之一，在食品和工業等方面應用廣泛。穗腐病菌不僅發生在玉米生長后期，也可發生在貯藏期造成籽粒霉爛，嚴重影響玉米的產量和質量。病原菌產生的毒素等次生代謝產物會引起人畜中毒，嚴重者甚至造成死亡[1]。
　　近年來，不斷有引起玉米穗腐病病原菌種類的報道，但大多數是在玉米生長后期進行樣本采集，且多數地區的優勢病原菌多為擬輪枝鐮孢或禾谷鐮孢復合種[23]，而關于在貯藏過程中引起玉米籽粒霉爛的病原菌種類的研究尚未見報道。溫度和濕度是影響穗腐病發生的主要因素，玉米灌漿成熟階段遇到連續陰雨天可加重穗腐病的發生，玉米在貯存過程中，當貯存溫度高于10℃或籽粒含水量大于14%時，也可加重籽粒霉爛[4]。
　　現有研究表明哈茨木霉復合種Trichoderma harzianum species complex包括至少14個種：貴州木霉T.guizhouense、哈茨木霉T.harzianum、非鉤木霉T.inhamatum、T.lentiforme、T.lixii、T.afarasin、非洲哈茨木霉T.afroharzianum、深褐木霉T.atrobrunneum、T.camerunense、T.endophyticum、T.neotropicale、T.pyramidale、T.rifaii和西蒙斯木霉T.simmonsii[5]。本研究在對采自山東省聊城市農戶家中貯藏的籽粒霉爛的玉米樣本進行病原菌分離鑒定的基礎上，采用elongation factor1α（EF1α）基因序列對分離到的哈茨木霉復合種進行分子鑒定，以明確引起山東省聊城市玉米貯藏過程中籽粒霉爛的木霉種類，為玉米在貯藏過程中的防治籽粒霉爛提供理論依據。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　玉米籽粒霉爛樣本：高唐縣11份、東昌府區11份、冠縣5份、茌平縣10份、陽谷縣17份。
　　馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L。
　　試劑：2×Es Taq Master Mix，北京康為世紀生物科技有限公司;真菌基因組DNA提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司;DL2000 DNA Marker，TaKaRa公司;50×TAE，上海生工生物工程有限公司;Biowest Agarose G10，南京生興生物技術有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 　　儀器：PCR儀，東勝龍ETC811;GelDoc XR+凝膠成像分析系統，美國BioRad公司;DYY11型電泳儀，北京六一儀器廠;Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機，上海力申科學儀器有限公司;HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司。
　　1.2 病原菌分離鑒定
　　取發病籽粒置于2.0%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，再以無菌水沖洗3遍，用滅菌濾紙吸干籽粒表面水分后將其放置在PDA平板上，于27℃黑暗條件下培養3～5 d，待長出菌絲后進行分離純化獲得單孢菌株，在新的PDA平板上27℃黑暗培養3～5 d后，參照《真菌鑒定手冊》[6]和《中國真菌志青霉屬及其相關有性型屬》[7]，根據菌落形態和分生孢子的大小及形態特征等對菌株進行初步的形態學鑒定。
　　將培養好的真菌用真菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，用真菌特異性引物ITS1/ITS4（ITS1：5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′;ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）[8]和鐮孢菌延伸因子引物EF1/EF2（EF1：5′ATGGGTAAGGARGACAAGAC3′;EF2：5′GGARGTACCAGTSATCATGTT3′）[9]進行分子生物學鑒定。PCR反應體系為：模板DNA 1.0 μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各0.5 μL，2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O補足至25.0 μL。PCR反應程序為：95℃預變性10 min;95℃變性1 min，退火溫度下退火30 s（ITS1/ITS4：56℃;EF1/EF2：53℃），72℃延伸45 s，共38個循環;72℃延伸10 min，4℃保存擴增產物。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。所有擴增產物均由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在NCBI進行BLAST比對。
　　1.3 哈茨木霉復合種鑒定
　　將經真菌通用引物ITS1/ITS4鑒定為哈茨木霉復合種的菌株，采用引物EF1728F（5′CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3′）[10]和TEF1LLErev（5′AACTTGCAGGCAATGTGG3′）[11]對其EF1α序列進行PCR擴增，PCR反應體系和PCR反應程序見1.2，其中退火溫度為53℃。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。所有擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在NCBI進行BLAST比對。以GenBank中哈茨木霉復合種相關序列為參考序列，利用MEGA 5.2軟件，采用鄰近法（neighborjoining）構建系統發育樹，進行哈茨木霉復合種下不同種的鑒定。
　　1.4 非洲哈茨木霉的致病性測定
　　將非洲哈茨木霉分離物在PDA培養基上28℃培養5 d，用無菌水沖洗菌落表面，獲得分生孢子，經紗布過濾后，配制成孢子含量為1×106個/mL的孢子懸浮液，采用花絲通道注射法接種到授粉后3 d的玉米果穗上。收獲前進行調查，記錄發病情況。
　　2 結果與分析
　　2.1 真菌的分離鑒定
　　經形態學鑒定，54份樣本中分離到的病原菌初步劃分為鐮孢屬Fusarium spp.、木霉屬Trichoderma spp.、青霉屬Penicillium spp.、曲霉屬Aspergillus spp.和絲核菌屬Rhizoctonia spp.;分子生物學鑒定結果進一步表明分離到的病原菌分別為擬輪枝鐮孢F.verticillioides、禾谷鐮孢復合種F.graminearum species complex、層出鐮孢F.proliferatum、哈茨木霉復合種T.harzianum species complex、棘孢木霉T.asperellum、黑曲霉A.niger、黃曲霉A.flavus、草酸青霉P.oxalicum、短密青霉P.brevicompactum和玉蜀黍絲核菌R.zeae。其中，除短密青霉外，其他真菌均是玉米穗腐病的已知致病菌。
　　2.2 真菌的分離頻率
　　10種真菌中，擬輪枝鐮孢的分離頻率最高，為31.48%;哈茨木霉復合種次之，為24.07%;然后為草酸青霉，為14.81%。擬輪枝鐮孢和哈茨木霉復合種在調查的5個縣（或區）均有分布;草酸青霉僅在冠縣未分離到;禾谷鐮孢復合種僅在東昌府區、茌平縣和陽谷縣分離得到;黑曲霉僅在陽谷縣和高唐縣分離得到;黃曲霉僅在高唐縣和東昌府區分離得到;玉蜀黍絲核菌僅在東昌府區和陽谷縣分離得到;層出鐮孢僅在東昌府區分離得到，棘孢木霉僅在高唐縣分離得到，短密青霉僅在冠縣分離到（表1）。
　　高唐縣擬輪枝鐮孢的分離頻率最高，為45.45%，是該縣的優勢病原菌，哈茨木霉復合種次之，僅為18.18%;東昌府區哈茨木霉復合種的分離頻率最高，為27.27%;冠縣擬輪枝鐮孢的分離頻率最高，為60.00%，是該縣的優勢病原菌;在茌平縣，擬輪枝鐮孢、哈茨木霉復合種、草酸青霉和禾谷鐮孢復合種的分離頻率相差不大;陽谷縣擬輪枝鐮孢和哈茨木霉復合種的分離頻率相同，均為29.41%，遠高于其他病原菌的分離頻率（表1）。
　　1） 各地點后面括號中的數字代表該地點的樣本數。
　　The numbers in brackets following the region represent the sample numbers at this location.
　　2.3 哈茨木霉復合種鑒定
　　用EF1α基因特異引物擴增出一條約為1 300 bp的片段，利用MEGA 5.2軟件，將哈茨木霉復合種分離物的EF1α基因序列與NCBI上已有的貴州哈茨木霉、哈茨木霉、西蒙斯哈茨木霉、非洲哈茨木霉等采用鄰近法（neighborjoining）構建系統發育樹，結果表明，11個哈茨木霉復合種分離物均與非洲哈茨木霉聚在同一分支上，表明其為非洲哈茨木霉Trichoderma afroharzianum（圖1），且在高唐縣、東昌府區、冠縣、茌平縣和陽谷縣均有分布。 　　2.4 非洲哈茨木霉的致病性測定
　　將鑒定為非洲哈茨木霉的病原菌接種玉米果穗后，玉米苞葉過早干枯，且在苞葉表面覆蓋綠色和白色霉層（圖2a）;果穗發生腐爛，不結實或結實籽粒較少（圖2b～c）。將發病組織進行病原菌分離純化，經形態和分子鑒定仍為非洲哈茨木霉。
　　3 結論與討論
　　國內外研究表明，玉米穗腐病的致病菌主要為擬輪枝鐮孢及禾谷鐮孢復合種，在本研究中，引起聊城市倉儲玉米穗腐病的優勢病原菌為擬輪枝鐮孢，占分離頻率的31.48%，但次優勢病原菌為哈茨木霉復合種，占分離頻率的24.07%，而禾谷鐮孢復合種的分離頻率僅為9.26%，這可能與哈茨木霉對禾谷鐮孢復合種有較強的抑制作用有關[12]。
　　玉米收獲前后易受到各種產毒真菌侵染，生長階段易感鐮孢菌，儲存階段易染曲霉[4]。在19世紀70年代美國就有關于貯存期引起玉米穗腐病青霉種類的報道[13]。在本研究中，雖然曲霉和青霉的分離頻率均高于生長階段采集樣本的分離頻率[14]，但遠低于擬輪枝鐮孢和哈茨木霉復合種的分離頻率。這可能是由于哈茨木霉生長速度快、繁殖能力強、適應范圍廣等特性有關[15]。
　　近年來，關于哈茨木霉的研究主要集中在對植物病害的生物防治方面[16]，而關于哈茨木霉是病原菌的研究較少。姚瑞麗通過柯赫氏法則證實哈茨木霉是玉米穗腐病的致病菌[17]。在我國，關于哈茨木霉復合種的研究較少。張廣志等在我國土壤中分離到哈茨木霉復合種中的非洲哈茨木霉、深褐木霉和西蒙斯木霉[18]。采用rDNAITS片段進行分子鑒定，只能將哈茨木霉鑒定到復合種水平，因此，多采用EF1α基因序列對哈茨木霉復合種進行鑒定，本研究將從玉米籽粒樣本上分離到的哈茨木霉復合種均鑒定為非洲哈茨木霉。按照柯赫氏法則對非洲哈茨木霉分離物進行致病性測定發現，非洲哈茨木霉能夠引起玉米穗腐病，且能夠侵染玉米的苞葉、籽粒和玉米軸，使玉米苞葉過早干枯，玉米結實率降低，嚴重影響玉米產量，病害癥狀與田間的木霉穗腐病相同。但非洲哈茨木霉是否對玉米質量有影響，有待進一步研究。
　　研究表明，玉米水分活度、環境溫度是決定儲存玉米籽粒霉變的主要因素。玉米籽粒含水量高或環境溫度和濕度波動大可能導致玉米霉變[4]。因此，明確引起倉儲玉米籽粒霉變病原菌的種類，可為進一步防治玉米倉儲病害提供理論依據。
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　　（責任編輯：楊明麗）
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