矮化核桃枝枯病病原菌的形態與分子鑒定
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摘要 為了明確河南省洛陽地區核桃枝條一種新病害的病原種類，對采自田間的典型癥狀枝條進行了常規組織分離，對單孢菌株進行了形態鑒定、rDNA ITS序列分析及致病性測定。結果表明，病原菌在PDA培養基上菌落初為白色，隨著色素的積累，由中心向邊緣變為灰綠色，再變成墨綠色，最終全部變成黑色;氣生菌絲棉絮毛狀，菌落邊緣不整齊，近圓形或不規則形。分生孢子器散生或聚生，呈黑色小粒狀，分生孢子器球形或近球形，深褐色，具孔口;分生孢子梗短缺，無色，桿狀，末端產生分生孢子;分生孢子梭形、紡錘形，無色，無隔，基部鈍圓，頂部稍尖，單孢（24.5～29.0）μm×（4.8～7.5）μm。離體枝條接種結果表明，該菌能侵染核桃枝條引起與田間相同的癥狀。據此將分離物鑒定為葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。
關鍵詞 核桃; 枝枯病; 葡萄座腔菌; 形態鑒定; 分子鑒定
中圖分類號： S 436.64
文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018252
Abstract In order to clarify the pathogen of a new disease of walnut branch in Luoyang， Henan province， routine tissue separation of typical symptomatic branches from the field was carried out， and the morphological identification， rDNAITS sequence analysis and pathogenicity determination were performed for single spore strains. The results showed that the colony of the pathogen was initially white in the PDA medium， and with the accumulation of pigment， it was graygreen from the center to the edge; then it turned atrovirens， and eventually it turned black; the aerial hyphae were floccular and hairy， with irregular colony edge and nearly round or irregular shape. Pycnidia were scattered or aggregated， with small black granules， spherical or nearly spherical， dark brown， with orifice; conidiophores were short， colorless， rodshaped， and at the termina were conidia; conidium was fusiform， colorless， without septum， with obtuserounded base， slightly pointed apex， and single spores （24.5-29.0）μm×（4.8-7.5）μm. The results of inoculation in excised branches showed that the pathogen could infect the walnut branches and cause the same symptoms as those in the field. Accordingly， the isolate was identified as Botryosphaeria dothidea.
Key words walnut; branch blight; Botryosphaeria dothidea; morphological identification; molecular identification
核桃仁因含有多種人體必需的微量元素、礦物質及一些維生素，具有較高的營養價值，是世界著名的“四大干果”之一[1]，深受消費者喜愛。近年來，種植核桃市場前景廣闊，經濟效益顯著，栽培面積迅速擴大;但由于苗木引進把關不嚴、栽培管理方式粗放等原因，病蟲危害日益加重[2]。已報道核桃真菌性病害有核桃白粉病[3]、核桃潰瘍病[4]、核桃枝枯病、核桃腐爛病[5]、核桃葉斑病[6]等，有多種病原真菌可以侵染核桃引起枝枯病，包括胡桃楸擬莖點霉Phomopsis juglandina，葡萄座腔菌屬的Botryosphaeria dothidea、B. fabicercianum、B.obtusa，半知菌亞門黑盤孢Melanconium juglandinum[7]以及新殼梭孢Neofusicoccumparvum[8]，越橘間座殼Diaporthe vaccinii[9]等。
傳統的真菌形態學鑒定為其分類提供了基本的依據，但是有一些真菌例如Botryosphaeria類真菌，僅依靠形態學特征并不能準確做出關于其發育的系統分類，而rDNA的ITS序列分析則可以彌補單獨依靠形態學特征所不能完成的真菌種、屬的鑒定[10]。
調查發現，在河南省洛陽市農豐科技有限公司核桃園所種植的矮化核桃品種，病害發生嚴重，影響了該公司核桃的產量、質量。為了查明病因，減少核桃種植的損失，課題組采集具典型癥狀的核桃枝枯病病樣，對病原菌進行分離培養、純化與鑒定，以進一步確定病原菌的種類，為枝枯病的防治提供理論依據。 1 材料與方法
1.1 病原菌的分離、純化與培養
2017年3月至2018年3月，從河南省洛陽市農豐科技有限公司核桃園采集具有典型病害癥狀的枝條，帶回實驗室進行流水清洗，依次編號并拍照。帶有病原菌子實體病癥的枝條，直接挑取子實體于PDA培養基上培養;無病原菌子實體病癥的枝條進行常規的病菌組織分離[11]。將分離純化獲得的菌株轉至PDA斜面試管保存。
1.2 致病性測定
挑選健康、幼嫩的矮化核桃枝條，無菌水沖洗，70%乙醇表面消毒;用滅菌針在枝條上針刺形成輕微傷口;用滅菌的打孔器將在PDA培養基上活化3 d的供試菌株菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，將菌餅有菌絲的一面粘貼于枝條的傷口處;將接種后的枝條置于保濕器內，25℃條件下光照培養，觀察記錄發病情況。以無菌的PDA菌餅為對照，重復3次[12]，每一重復5個枝條。
1.3 病原菌的形態學觀察
將分離純化的菌株接種于PDA培養基，置于25℃恒溫培養箱中培養，5 d后測量菌落的直徑，觀察菌落顏色、表面的紋飾、形態與質地，描述其培養特征。
從田間采回的發病枝條，選取具子實體的典型樣本，制臨時水玻片，在光學顯微鏡（帶測微尺）下觀察其形態特征，并測量分生孢子、分生孢子器、子囊座、子囊及子囊孢子的大小;選取具子實體的發病枝條，進行石蠟切片[12]，在顯微鏡下進一步觀察病原菌的形態特征。
1.4 rDNAITS序列分析
在PDA上培養5～7 d后的菌落，用改良的CTAB法[13]提取菌株DNA;利用通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）將提取出來的DNA進行PCR擴增。設計25 μL PCR反應體系：10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、10 μmol/L ITS1 1 μL、10 μmol/L ITS4 1 μL、5 U/μL rTaq酶 0.25 μL、模板DNA 1.0 μL，用ddH2O將反應體系補至25 μL。反應條件為：94℃預變性5 min;94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸105 s，共30個循環;最后72℃延伸10 min。反應結束后，4℃保存，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，經GelRed染色，在紫外燈下檢測擴增產物的有效性。檢測到合適條帶后，將其所對應的原始擴增產物（未純化）送交上海生物工程有限公司進行序列測定。
獲得序列用CLUSTAL軟件比對拼接后，在GenBank數據庫中用 BLAST進行ITS序列比對，將目標序列及其同源性高的序列編輯后，通過MEGA 軟件用鄰接法（neighbourjoining）構建進化樹。
2 結果與分析
2.1 分離物的致病性
在核桃園，枝枯病一般發生在樹干的側枝或新生枝的末端，發生病變的枝干表層呈現暗灰褐色、或者淺紅褐色、或深灰色，呈干枯狀（圖1a）。發生病害部位與其他地方相比稍微凹陷，并與健康部位交界處形成“V”形或橢圓形病斑，顏色深褐色（圖1b）;在發病后期，出現典型的病征：病枝皮層下會形成許多近圓形瘤狀突起的小黑點，直徑大約0.4 mm，埋生或半埋生，群生且較密，為病原菌的分生孢子器或子囊座（圖1c、d）。有的核桃樹主枝上也有，說明發病后病菌會從側枝逐漸蔓延到主枝;患病枝條的葉片黃化、枯萎、卷曲，甚至脫落。
人工接種第2～3天后，在幼嫩枝條上接有菌餅的地方出現橢圓形或“V”形病斑，病斑處顏色為褐色，中部顏色較淺，水漬狀，且略微有凹陷，大小約為1.6 cm×0.7 cm（圖2a、b）。接種第5天，對照組不發?。▓D2c），而接種核桃枝條在原接種處有白色棉絮狀菌絲產生，并且褐色病斑已擴展至整根枝條的2/3左右，侵染嚴重的地方顏色變為深灰色近乎黑色（圖2d）。接種15 d，整根枝條變為黑色，且在枝條上出現黑色小點（圖2e）。從接種發病的核桃枝條上挑取菌絲、小黑點，以及從病健交界處獲取發病組織，再次進行分離、純化，重新獲得了病原菌，且菌落形態和分生孢子形態上與接種所用的病原菌完全一致，證實該菌對矮化核桃枝條具有致病性，并產生枝枯癥狀。
2.2 形態學特征
在田間發病的枝條上，分生孢子器和子囊座自皮層下頂出，呈黑色瘤狀突起，群生。分生孢子器黑色，球形或近球形。光學顯微鏡下觀察，分生孢子器球形或近球形，顏色深褐色或黑色，具孔口（104.3～115.2）μm×（118.5～123.2）μm（平均110.0 μm×120.0 μm）（圖3a）;分生孢子梭形、紡錘形，無色，單孢（25.0～31.2）μm×（5.8～8.0）μm（平均27.1 μm×7.3 μm）（圖3b）。子囊座黑色，具孔口（220.0～228.0）μm×（260.0～276.0）μm（平均224.0 μm×275.0 μm）（圖3c）;子囊長棍棒形，具短柄，雙層壁，成熟時易消解（19.8～22.3）μm×（147.5～158.2）μm（平均20.7 μm×150.0 μm），內含8個子囊孢子（圖3d）;子囊孢子雙列，橢圓形，單孢，無色，內有油滴狀物（17.8～26.3）μm×（8.4～12.5）μm（平均24.6 μm×11.2 μm）（圖3d）。
在PDA培養基上，菌絲3～4 d即可布滿全皿（90 mm），菌落初為白色（圖4a1、a2），漸變為灰色、黑色，氣生菌絲棉絮毛狀，在培養皿中部往往形成菌絲束直達皿蓋（圖4c1、c2）;菌落邊緣不整齊，近圓形或不規則形，培養3～4 d后出現色素，隨著色素的積累，由中心向邊緣初為灰綠色，再變成墨綠色，最終全部變成黑色。菌落日生長速率約為17.1 mm/d。6～7 d左右，部分菌絲糾結在皿底形成分生孢子器，散生或聚生，呈黑色小粒狀，內有大量分生孢子（圖4b1、b2）。光學顯微鏡下觀察，菌絲透明無色或褐色，有隔，直徑約為4.8 μm。分生孢子器球形或近球形，深褐色，具孔口（圖3e）;分生孢子梗短缺，無色，桿狀，末端產生分生孢子（圖3f）;分生孢子梭形、紡錘形，無色，無隔，基部鈍圓，頂部稍尖，單孢（24.5～29.0）μm×（4.8～7.5）μm（平均26.2 μm×5.4 μm）（圖3f）。在PDA上培養的菌株未發現子囊座、子囊以及子囊孢子。根據形態學觀察，初步鑒定分離菌株為葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。 2.3 rDNAITS序列分析
對分離物的PCR產物雙向測序后，其有效序列長度577 bp。將分離物測序獲得的序列上傳至GenBank數據庫，獲得其ITS序列登錄號為：MH329650。在GenBank中進行Blast比對，結果表明，該序列與KU686880.1等的B.dothidea（葡萄座腔菌）序列同源性大于99%。結合形態學鑒定結果，將分離的核桃枝枯病病原菌鑒定為葡萄座腔菌B.dothidea，其分類地位為真菌界，子囊菌門，腔菌綱，格孢腔菌目，葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌屬（圖5）。
3 結論與討論
依據分離物的形態學觀察、ITS序列分析及致病性測定，將引起洛陽地區矮化核桃枝枯病的病原菌鑒定為葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，其分類地位為真菌界，子囊菌門，腔菌綱，格孢腔菌目，葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌屬。該病原菌與趙丹等[12]報道的引起洛陽牡丹潰瘍病的葡萄座腔菌以及徐成楠等[14]報道的引起遼寧地區越橘枝枯病的葡萄座腔菌相一致。
葡萄座腔菌存在有性型和無性型階段，關于無性型的報道比較多，包括Dothiorella、Diplodia、Lasiodiplodia、Fusicoccum和Sphaeropsis等屬[15]。其主要分類特征為子座、子囊、子囊孢子以及分生孢子的形狀、紋飾、顏色、分隔、長寬比、大小及壁厚度等[16]。但是，由于在自然界和實驗室人工條件下培養的葡萄座腔菌Botryosphaeriaceae通常以無性型較常見，有性型少見，長期以來對于該屬真菌的分類學鑒定主要基于無性型的形態特征。另外，培養菌落顏色、氣生菌絲生長情況及子囊孢子表面超微結構（紋飾）也可用于葡萄座腔菌科真菌的分類和鑒定。隨著分子生物學的快速發展，rDNAITS序列分析作為一種快速準確的手段被廣泛用于植物病原真菌的分類鑒定[17]。核糖體DNA轉錄間隔區（rDNAITS）序列是真核生物rDNA的內含子序列，因其在進化上具有顯著的種屬特異性，已被廣泛應用于很多真菌目、科、屬、種等的分類鑒定及系統發育分析。位于5.8S和18S之間的ITS1，在種及種以下水平的研究中非常有價值。位于5.8S和28S之間的ITS2，有關研究證明其在更高級生物分類學水平上包含有價值的生物學信息。因此ITS序列可用于了解基因組同源性、物種系統發育史、基因滲透和其他進化問題[18]。
葡萄座腔菌是一類世界性分布的真菌，在國外引起藍莓枝枯病[19]、蘋果輪紋病[20]、葡萄潰瘍病[21]等病害。在國內主要分布于華北、東北、江淮等地區，侵染多種木本植物引起潰瘍病或干腐病，是重要的生物災害之一[22]。該菌在河南洛陽侵染核桃引起大片干枯死亡，造成嚴重的經濟損失，建議生產中應冬季清除病原，早春提前預防，降低病害的危害程度。
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