甜瓜靶斑病病原菌鑒定

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　　摘    要： 甜瓜（Cucumis melo L.）是我國重要的瓜類經濟作物。2015年10月在我國廣西武鳴甜瓜主要種植區進行病害調查時發現一種新的葉斑病。該病原菌疑似通常危害植物葉片引起葉斑病的多主棒孢菌。采用形態學觀察，多基因鑒定和致病性試驗的方法對引起該病的病原菌進行了鑒定。病原菌菌落中間墨綠色，邊緣淺褐色，有明顯的生長圈，氣生菌絲茂密。分生孢子呈圓柱形或倒棍棒形，單生或串生，直立或稍微彎曲，具0～13個隔膜，大小為（3.1～6.4） μm × （14.0～138.9） μm。克隆測定該病原菌的4個保守序列ITS1，2、ITS4，5、ACT和TUB2。分離純化的病原菌回接到甜瓜幼苗，表現出與田間相似的癥狀，符合柯赫氏法則，鑒定該病原菌為多主棒孢。該病原菌也可侵染西瓜（Citrullus vulgaris Schrad.）和黃瓜（Cucumis sativus L.）幼苗及離體葉片使其發病。
　　關鍵詞： 甜瓜; 多主棒孢; 鑒定
　　Identification of Corynespora cassiicola infecting muskmelon （Cucumis melo L.） in China
　　LI Junxiang1，2， HONG Ni2， HONG Rixin3， LIU Xi1， GU Qinsheng1
　　（1. Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. College of Plant Science & Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， Hubei， China; 3. Horticultural Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， Guangxi， China）
　　Abstract： Muskmelon （Cucumis melo L.） is one of the most economically important cucurbit crops grown commercially in China. A new leaf spot disease was observed on muskmelon in October 2015， in Wuming， Guangxi province， China. The disease exhibited symptoms of target spot.  Morphological characteristics， multiple-gene sequencing， and pathogenicity tests were used to identify the causal organism. The fungal isolate produced a colony with brownish or greenish concentric growth rings and abundant aerial mycelia. The conidia were solitary， hyaline， cylindrical， oval or obclavate， straight or curve， 0-13-septate and （3.1-6.4） μm × （14.0-138.9） μm. The isolate was sequenced using four genomic loci， from ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences [ITS1， ITS2（ITS1，2）， ITS4 and ITS5（ITS4，5）]， and the actin （ACT）， β-tubulin （TUB2） genes. The purified Guangxi isolate infected all tested genotypes of muskmelon， watermelon （Citrullus vulgaris Schrad.）， and cucumber （Cucumis sativus L.）， in seedlings and detached leaves， and was consistently reisolated from diseased leaves， satisfying Koch’s postulates. Our results identified the pathogen as C. cassiicola.
　　Key words： Muskmelon; Corynespora cassiicola; Identification
　　多主棒孢[Corynespora cassiicola （Berk. & M. A. Curtis） C. T. Wei]可危害390種亞熱帶和熱帶植物[1]，寄主范圍廣泛，屬于重要植物病原菌[2]。該病原菌可侵染植物的各個部位，但主要危害植物葉部形成靶斑狀病斑[3-4]。葫蘆科作物甜瓜是我國重要的經濟作物，栽培廣泛。多主棒孢在甜瓜上曾經屬于次要病害，直到2013年，海南三亞生長后期的甜瓜該病害嚴重發生，發病株率為30%～50%[5]。2015年10月，中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控實驗室在我國廣西武鳴甜瓜種植區進行病害調查時發現一種新的葉斑病，典型癥狀為主要危害甜瓜葉片產生不規則或圓形靶狀病斑，棕色或帶有黃色暈圈呈輪紋狀。將病樣帶回，進行分離鑒定、形態學觀察及致病性分析。 　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　試驗于2016年 4—8月在中國農業科學院鄭州果樹研究所病菌培養實驗室進行。供試菌株為多主棒孢（Corynespora cassiicola）甜瓜分離物廣西菌株Cc-GX，為本試驗室分離鑒定并保存。馬鈴薯瓊脂培養基（Potato Dextrose Agar，PDA）：馬鈴薯去皮切薄片200 g，加水煮沸30 min，雙層紗布過濾，加2%葡萄糖，1.5%瓊脂，定容至1 L。1.2%水瓊脂培養基（Water Agar， WA）：瓊脂12 g，蒸餾水定容至1 L。0.1 MPa壓力下，121 ℃濕熱滅菌20 min。
　　1.2 方法
　　1.2.1 甜瓜靶斑病的標本采集 2015年10月在我國廣西武鳴甜瓜主要種植區進行病害調查時發現甜瓜靶斑病。采集具有典型病斑的甜瓜葉片，帶回備用。
　　1.2.2 病原菌的分離及純化 通過組織分離培養法，在病健交界處依次將病葉樣本切成0.5 cm×0.5 cm近似大小的葉片組織塊。再將葉片組織塊放入0.5%的次氯酸鈉溶液進行表面消毒2 min，隨后置于無菌水中漂洗3次并于滅菌的干燥濾紙上晾干，最后接種于PDA平板上，27 ℃恒溫箱黑暗培養。3 d后，用接種針挑取病斑組織邊緣長出的菌絲，轉接到新的PDA上進行純化培養，并依次轉接重復多次以獲得純菌株。然后進行顯微形態鑒定，再將純化菌株轉接于PDA斜面，于4 ℃冰箱保存[6]。
　　1.2.3 病原菌菌落形態觀察 將斜面上保存的菌落，轉接于PDA平板中，于27 ℃黑暗活化培養5 d。然后，用滅菌的打孔器從菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，再依次將菌餅放置到新的PDA平板中央，每個平板接種1塊菌餅。再將接種后的平板置于恒溫培養箱中，于27 ℃黑暗培養3、5、7、9 d后觀察記錄菌落形態。
　　1.2.4 病原菌分生孢子形態觀察 將斜面上保存的菌落，轉接于PDA平板中，于27 ℃黑暗活化培養5 d。然后，用滅菌的打孔器從菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，再依次將菌餅放置到新的PDA平板中央，每個平板接種1塊菌餅。再將接種后的平板置于恒溫培養箱中，于27 ℃黑暗培養20 d使其自然產孢。然后，分別在各平板菌落上加10 mL無菌水，再用滅菌的毛筆掃落孢子，3層擦鏡紙過濾獲得孢子懸浮液。顯微鏡觀察記錄50個分生孢子的形狀，測量孢子的大小并拍照。
　　1.2.5 甜瓜靶斑病菌的分子鑒定 提取甜瓜靶斑病菌菌絲DNA。按以下反應體系和程序進行PCR擴增，引物序列詳見表1[7-11]。
　　ITS1，2的PCR反應體系為：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL;2.5 mmol·L-1 dNTPs 2.0 μL;10 μmol·L-1的上下游引物各1.0 μL;5 U·μL-1的Taq DNA 聚合酶0.5 μL;20 ng·L-1的DNA模板2.0 μL;用ddH2O補齊至總體積25 μL。反應程序：94 ℃預變性 2 min;94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃延伸5 min;4 ℃保溫。
　　ITS4，5的PCR反應體系為：10×PCR Buffer（含Mg2+）4 μL;3.2 mmol·L-1 dNTPs 2.0 μL;10 μmol·L-1的上下游引物各2.0 μL;5 U·μL-1的Taq DNA 聚合酶0.4 μL;20 ng·L-1的DNA模板2.0 μL;用ddH2O補齊至總體積50 μL。反應程序：94 ℃預變性 3 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃延伸5 min;4 ℃保溫。
　　ACT的PCR反應為：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL; 2.5 mmol·L-1 dNTPs 2.0 μL;10 μmol·L-1的上下游引物各1.0 μL;5 U·μL-1的Taq DNA 聚合酶0.5 μL;20 ng·L-1的DNA模板2.0 μL;用ddH2O補齊至總體積25 μL。反應程序：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保溫。
　　TUB2的PCR反應體系為：2×PCR Buffer（含Mg2+）25 μL;2.0 mmol·L-1 dNTPs 10.0 μL;10 μmol·L-1的上下游引物各1.0 μL;1 U·μL-1的KOD FX Neo聚合酶1 μL;20 ng·L-1的DNA模板2.0 μL;用ddH2O補齊至總體積50 μL。反應程序：94 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，30個循環;68 ℃延伸7 min;4 ℃保溫。
　　PCR產物經1%的低熔點瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后，在凝膠成像系統上觀察、拍照。
　　1.2.6 甜瓜靶斑病菌的致病性鑒定 采用苗期噴施孢子懸浮液和離體葉片孢子接種2種方法，進行致病性測定。將斜面上保存的菌落，轉接于PDA平板中，于27 ℃活化培養5 d。然后，用滅菌的打孔器從菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，再依次將菌餅放置到新的PDA平板中央，每個平板接種1塊菌餅。再將接種后的平板置于恒溫培養箱中，于27 ℃黑暗培養20 d使其自然產孢。然后，分別在各平板菌落上加10 mL無菌水，再用滅菌的毛筆掃落孢子，3層擦鏡紙過濾獲得孢子懸浮液。在顯微鏡下，采用血球計數板計數，并用無菌水將孢子濃度調至1×105孢子·mL-1。
　　苗期噴施孢子懸浮液接種。28 ℃溫室播種甜瓜（‘好運8’，購自廣西農業科學院園藝研究所）、西瓜（‘紅和平’，購自浙江浙農種業有限公司）和黃瓜（‘黑優301’，購自河南豫藝種業科技發展有限公司）種子，2周后進行接種。每個品種接種10株苗，3次重復，處理苗噴霧接種孢子懸浮液，對照噴霧接種無菌水。接種后于28 ℃溫室先黑暗保濕培養48 h，然后再進行常規管理。接種2周后觀察癥狀。如果接種葉片出現擴大的病斑則認為該病原菌有致病性，否則沒有。 　　離體葉片接種孢子懸浮液致病性測定。于28 ℃溫室播種甜瓜（‘好運8’）， 西瓜（‘紅和平’）和黃瓜（‘黑優301’）種子，采集生長11～14 d的種苗真葉。離體葉片用0.5%的次氯酸鈉溶液進行表面消毒2 min，隨后置于無菌水中漂洗3次并于滅菌的干燥濾紙上晾干。晾干后的葉片置于1.2%的WA平板上，每個葉片于不同位置接種5滴孢子懸浮液（1×105 孢子·mL-1），每個位置接種1滴，每滴10 μL，對照接種無菌水，于恒溫箱里28 ℃黑暗保濕培養。每個處理3次重復。3 d后觀察癥狀，如果葉片接種位點出現病斑，則認為有致病性，否則沒有致病性。
　　1.3 儀器設備
　　主要儀器設備：顯微鏡（Olympus BX51，東京，日本），血球計數板（XB-K-25，上海求精生化試劑儀器有限公司），光照培養箱（GXM-250BS，寧波市科技園區新江南儀器有限公司），潔凈工作臺（DL-CJ-2N，北京東聯哈爾儀器制造有限公司）。
　　2 結果與分析
　　2.1 甜瓜靶斑病的田間癥狀
　　2015年10月在我國廣西武鳴甜瓜主要種植區進行病害調查時發現甜瓜靶斑病，發病率100%（圖1-a）。該病害典型癥狀表現為僅危害葉片，發病初期病斑為黃褐色或淡褐色小點。病斑擴展后，葉片正面病斑略微凹陷，病斑近圓形，病斑中部淡黃色，邊緣顏色稍深，棕色或褐色，有時有黃色暈圈呈現明顯輪紋狀（圖1-b）。后期，病斑擴大，受葉脈限制，呈現不規則形或圓形，病斑融合，嚴重時葉片大面積干枯死亡，造成提早拉秧。
　　2.2 甜瓜靶斑病菌菌落形態
　　甜瓜靶斑病病原菌，27 ℃黑暗條件下，在PDA上培養3 d后，菌落直徑3 cm，菌絲白色，均勻地向四周擴散，菌落疏松。5 d后，菌落直徑5 cm，中央0.1～0.2 cm范圍內顏色變深，呈淺褐色，菌絲生長緊密，上面隆起，菌落邊緣顏色稍淺，菌落表面覆有大量氣生菌絲。7 d后，菌落顏色加深明顯，中間墨綠色，邊緣淺褐色，菌落圓形，生長均勻。9 d后，菌落直徑約達到9 cm，基內菌絲產生深褐色色素，形成輪紋狀的產孢區（圖1-c與1-d）。
　　2.3 甜瓜靶斑病病原菌顯微形態
　　甜瓜靶斑病病原菌在顯微鏡下菌絲呈半透明狀，具有分枝和隔膜，細胞壁光滑。該病原菌的分生孢子梗是由成熟的菌絲衍化來的，顏色偏棕，單生，直立或彎曲，有分隔。分生孢子頂生，多呈圓柱形或倒棍棒形，少有紡錘形，偶見“Y”字形，單生或串生，直立或稍微彎曲，呈半透明或淺橄欖色，具有0～13個假隔膜。PDA培養基上，分生孢子大小多樣化，為（3.1～6.4） μm × （14.0～138.9） μm（圖2）。
　　2.4 甜瓜靶斑病菌分子鑒定
　　提取甜瓜靶斑病病原菌的全基因組DNA并純化。以全基因組DNA為模板，分別使用4對特異引物對應擴增ITS1，2、ITS4，5、ACT和TUB2基因片段。擴增片段經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗，均完全符合目的片段的大?。▓D3）。擴增片段經純化、序列測定后，在NCBI數據庫進行序列比對。結果表明，病原菌為多主棒孢。
　　2.5 甜瓜靶斑病菌致病性測定
　　采用植物苗期噴施孢子懸浮液和離體葉片孢子接種兩種方法，進行致病性測定。
　　孢子懸浮液噴霧接種2周大的甜瓜（‘好運8’），西瓜（‘紅和平’）和黃瓜（‘黑優301’）幼苗。接種后于28 ℃溫室保濕黑暗培養2 d，然后28 ℃溫室常規管理。接種2周后觀察癥狀發現，甜瓜靶斑病菌廣西分離株可侵染甜瓜、西瓜和黃瓜。不同作物發病初期，葉面病斑均表現為黃褐色或淡褐色小點。之后，甜瓜上病斑擴展，葉片正面病斑略微凹陷，病斑近圓形，病斑中部淡黃色，邊緣顏色稍深，棕色或褐色，有時有黃色暈圈呈現明顯輪紋狀。西瓜上，病斑偏小，擴展有限。黃瓜上，病斑密集，病斑大小居中（圖4）。
　　甜瓜（‘好運8’），西瓜（‘紅和平’）和黃瓜（‘黑優301’）28 ℃溫室生長11～14 d的種苗真葉離體葉片接種孢子懸浮液滴致病性測定。接種后，于恒溫箱里28 ℃黑暗保濕培養3 d。觀察癥狀發現甜瓜、西瓜和黃瓜離體葉片在接種點處均有病斑出現，病斑呈黃褐色或淡褐色，并均可觀察到少量菌絲。不同作物病害癥狀差別不大（圖5）。
　　從孢子懸浮液噴霧接種的甜瓜幼苗上采集發病葉片，重新分離鑒定，發現病原菌是多主棒孢。且接種甜瓜幼苗表現出與病害調查時田間相似的癥狀，說明病害鑒定正確，符合柯赫氏法則。
　　3 討 論
　　2015年10月在我國廣西武鳴甜瓜主要種植區進行病害調查時發現一種新的葉斑病，受害葉片經分離鑒定確定其病原菌為多主棒孢。在PDA平板上，病原菌菌落圓形，中間墨綠色，邊緣淺褐色，該廣西分離株菌落顏色比報道的三亞分離株偏深，但同樣有生長圈，分生孢子比其偏小，但隔膜范圍更大[5]。更早的研究認為多主棒孢分生孢子大小具有更大程度的多樣性，但隔膜偏多[12]。這種差異可能是不同地區，不同作物分離的不同菌株導致的。
　　多主棒孢傳統的鑒定方法基于形態特征，但是這給相似近源種的區分增加了困難。如果僅僅通過形態學鑒定，可能會產生各種各樣的偏差。本研究通過PCR擴增得到該病原菌的4個保守序列ITS1，2、ITS4，5、ACT和TUB2，序列比對結果進一步證明該病原菌屬于多主棒孢。因為多主棒孢寄主范圍廣泛，可侵染番茄[13-14]、煙草[15]、黃瓜[9]、棉花[16]、大豆[17-18]、芝麻[19]、橡膠[20]等多種作物，采用多基因鑒定，結果更加準確。
　　致病性測定是病原菌鑒定的關鍵步驟之一，多主棒孢尤其如此，因為多主棒孢的有些菌株可侵染多種植物[21]，而另外一些菌株則表現出寄主專一性[22-25]。筆者發現，多主棒孢甜瓜分離物廣西菌株既可以侵染甜瓜，也可侵染西瓜和黃瓜，而這3種葫蘆科作物是我國廣泛種植的重要經濟作物。目前有很多關于黃瓜上多主棒孢的研究，而甜瓜上鮮有報道。正確的診斷和鑒定病原菌是制定病害防控策略的先決條件，筆者在本研究中揭示了多主棒孢在甜瓜上的危害及流行風險（該病害很有可能從次要病害上升為主要病害），以期為病害防治提供依據。 　　參考文獻
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