翅形態特征在重陽木斑蛾成蟲性別鑒定中的應用

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　　摘要 為了明確重陽木斑蛾的翅形態特征在其性別鑒定中的作用，探索雌雄難于區分的成蟲的數值鑒定方法。采用圖像處理與分析技術，通過愛普生掃描儀獲取重陽木斑蛾前翅圖，利用BugShape v1.0軟件提取雌雄成蟲翅的輪廓特征，利用tpsDig2軟件獲取翅脈交叉點位置特征，并利用獨立樣本t檢驗和標志點空間普氏疊加和扭曲分析，以明確此類特征在該成蟲雌雄鑒定中的作用。結果表明，重陽木斑蛾成蟲左右前翅輪廓特征在同一性別中差異不顯著。僅利用左前翅數據進行分析時，翅面積、短軸長度、等效圓半徑、偏心率、球狀性和圓形度在兩個性別中存在極顯著差異，周長和長軸長度的差異達到顯著水平，而緊湊度和葉狀性差異不顯著。使用左右前翅作為數據集進行分析時，除緊湊度和葉狀性差異仍不顯著外，其余參數均達到極顯著水平。雌雄前翅輪廓特征作為指標來判別性別時正確率為100%，但存在左右翅相互錯判現象。翅膀內部翅脈交叉點的空間位置在個體間存在較大差異，主要表現在相對于翅的橫向方向變異大。雌雄間的差異主要存在于外緣附近的翅脈交叉點。結論：通過前翅的輪廓特征可以區分重陽木斑蛾雌雄成蟲的差異。翅脈交叉點空間位置在雌雄間和個體間存在一定的變異。
　　關鍵詞 重陽木斑蛾; 數值分類; 特征提取; 翅脈交點; 雌雄判別
　　中圖分類號： S 431.9
　　文獻標識碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018310
　　Abstract Picture processing and analysis technology was employed to clarify the effects of wing morphological characteristics of Histia rhodope adults on sex recognition and explore the numerical identification method for these adults whose sex is hard to recognize. Forewing images of H.rhodope were captured by flatplate scanner （Epson Perfection V370 Photo） with transparent adapter. The contour feature of wings from female and male adults was extracted by the software BugShape v1.0， and the landmarks of veinjunctions were acquired using tpsDig2. Independentsample t test， Procrustes superimposition of the landmarks and relative warps were computed to verify the effects of the parameters on sex identification. The results showed that there was no significant difference in contour features between two side wings from the same sexual cases. Data analysis based on the left wings showed that the most parameters， such as area， short axis length， equalradius， eccentricity， sphericity and circularity， exhibited highly significant differences （α=0.01）， or significant difference （α=0.05） in terms of perimeter and long axis length， but no significant difference existed in compactness and lobation between male and female samples. However， except for the two parameters compactness and lobation， the difference was highly significant （α=0.01） in the other parameters between male and female adults. Although some samples were not assigned to right groups between left and right wings， the accuracy distinguishing males and females was up to 100% by using forewing outline features as indicators. The spatial positions of vein landmarks showed remarkable variation， especially in transverse direction of wings， between male or female samples. There was wide variation between female and male adults in the vein landmark positions nearby the outer margin of wings. It is concluded that the difference between male and female H.rhodope adults can be distinguished by using the contour feature of fore wings. Some variation exists among the sexes and samples in the spatial position of the vein landmarks. 　　Key words Histia rhodope; numerical taxonomy; feature extraction; veinjunction; sex identification
　　重陽木斑蛾Histia rhodope Cramer，又名重陽木帆錦斑蛾[1]、重陽木錦斑蛾[2]，屬于鱗翅目Lepidoptera斑蛾科Zygaenidae昆蟲，其寄主植物除重陽木Bischofia trifoliata Hook外，還包括板栗Castanea mollissima Blume[3]。據《中國農業昆蟲》和《中國蛾類圖鑒（Ⅰ）》描述，該害蟲雄蛾翅展47～54 mm，雌蛾61～64 mm[45]。1983年戴鳳鳳報道江西德興縣大茅山地區重陽木斑蛾雌雄成蟲翅展分別為50～60 mm和44～50 mm[6]。另據報道，在福州該蟲的體長、翅展和翅長在雌雄間無明顯差異[7]。通過文獻比較，我們發現不同地區或不同年份關于重陽木斑蛾雌雄成蟲翅展或翅長的描述不盡相同，雌雄個體間在翅形和翅長等方面有無差異存在一定爭議。
　　圖像處理與分析技術的發展為此類問題的解決提供了強有力的工具。利用相關技術，國內外有許多關于不同種類昆蟲翅形結構差異等方面的報道。比如，在膜翅目Hymenoptera昆蟲中，Weeks等在20世紀末報道了5種姬蜂科Ichneumonidae昆蟲的翅形態差異，并實現了此類昆蟲的種類鑒定[89]，出現了用于此類昆蟲形態特征提取與鑒定的軟件ABIS[10]和DrawWing[11]。在鱗翅目Lepidoptera昆蟲鑒定中，Watson等利用DAISY（digital automated identification system）系統對237種（每種20個進行訓練）活體標本圖像進行了分析，平均正確率83%，而無法對鱗片缺失或光照不均勻圖片進行正確的歸類[12]，后續通過對35種鱗翅目昆蟲774個活體標本的處理，并通過數據挖掘分析，成功率略有上升，達到85%[13]。而Zhu 等使用翅圖的顏色特征，如顏色直方圖和灰度共生矩陣等特征，對100種鱗翅目昆蟲的正確識別率為71.1%[14]。除了利用與上述顏色或光照影響相關的特征外，利用翅輪廓特征對昆蟲進行分類鑒定效果要好一些，如Yang等利用翅輪廓特征對120張7種蝶角蛉Ascalaphidae圖片進行分析，準確率為90%～98%，而再添加復眼特征后，準確率會上升到99%[15]。這說明，依托昆蟲數字化技術的數值分類效果與特征選擇有很大關系，同時也與昆蟲種類有密切關系。根據上述研究結果，可以初步認為翅形等特征是昆蟲數值分類鑒定中的重要參數來源。
　　為了明確重陽木斑蛾成蟲不同性別之間在翅形態結構上的差異，本研究擬利用圖像處理與分析技術，對信陽地區發生的重陽木斑蛾進行形態測量學研究。研究結果不但可以為鱗翅目昆蟲數值分類提供理論依據，為此類昆蟲種類的遠程鑒定篩選有效的參數，也為此類昆蟲成蟲的雌雄鑒定提供技術保障，為解決蝶類等雌雄難辨昆蟲的性別鑒定提供一種方法。
　　1 材料與方法
　　1.1 標本處理
　　本試驗中的重陽木斑蛾成蟲（圖1）采集時間為2017年8月20日，采集地點為河南省信陽市信陽農林學院校內，采集之前未使用化學農藥進行防治，可以排除使用殺蟲劑對成蟲翅形態特征的影響。從整理后的標本可以看出雌雄間除個體大小有差異外，腹部黑斑的大小以及黑斑間距在雌雄個體間有明顯不同，但從生態照片上很難進行區分（圖1）。
　　雌雄成蟲各50頭進行乙酸乙酯熏蒸處理，剪取前后翅并使用化學去鱗方法[16]，去除翅表鱗片，制作成翅脈標本。最終選擇翅面無折疊、無破損的完整翅脈標本雌雄各19頭進行圖像獲取和特征提取，共得到雌雄左前翅圖片各19張，雌蟲右前翅圖片16張，雄蟲右前翅圖片13張。而由于后翅柔軟、易破損，只得到雌蟲左后翅圖1張、右后翅圖6張，雄蟲右后翅圖3張，這部分數據過少，未做分析。
　　1.2 圖像獲取
　　本研究使用愛普生平板式掃描儀（Epson Perfection V370 Photo）作為翅圖像獲取的主要工具。通過比較幾種掃描模式（膠片、反射稿、反射稿+平面光源）的圖像效果，最終選擇使用膠片模式進行掃描，分辨率設定為2 400 dpi。每個翅作為獨立文件保存為.bmp格式，以便后期各軟件的特征提取。
　　1.3 特征提取
　　本研究首先使用了由中國農業大學IPMist實驗室開發的BugShape v1.0軟件[17]，對翅的外部形態特征進行了自動獲取，為保證提取的參數能準確代表翅的輪廓特征，每張翅圖提取兩次，一次為所有參數由軟件自動調節，另一次為手動調節，最終得到翅的面積、周長、長軸長度、短軸長度、等效圓半徑、偏心率、緊湊度、葉狀性和圓形度10個參數[18]。此外，利用美國F. James Rohlf開發的一系列tps軟件（http：∥129.49.19.42/ee/rohlf/software.html）進行了翅脈交叉點數據提取與分析，如利用tpsDig2[19]獲取重陽木斑蛾前翅內部13個翅脈交叉點數據等。
　　1.4 分析方法
　　同一性別重陽木斑蛾左右前翅看作兩個處理，不同性別前翅作為兩個處理，利用獨立樣本t檢驗檢測由BugShape v1.0軟件得到的10個參數在不同處理中的差異性。在進行典型判別分析（canonical discriminat analysis）時，把兩個性別和左右兩側的翅分別看作不同的處理，即4個處理（雌性左翅、雌性右翅、雄性左翅和雄性右翅），通過獲得的參數建立Fisher判別函數，并對各樣本進行分組判別，上述分析在SPSS 22.0中進行。而利用tpsDig2獲取的翅脈交點坐標，使用其專用的軟件tpsSuper進行普氏疊加分析，疊加分析后再利用tpsRelw進行相對扭曲分析[19]，以分析重陽木斑蛾翅內部翅脈交叉點在空間分布上的變化。 　　2 結果與分析
　　2.1 成蟲左右前翅形態學參數在同一性別中的差異
　　雌蟲數據通過Levene變異數相等測試，各參數的顯著性P值在0.123～0.945之間，說明雌蟲左前翅和右前翅數據集整齊度好。獨立樣本t檢驗（n=19，16）結果表明，各參數的顯著性P值范圍為0.289～0.878，差異均不顯著。同樣，在雄蟲左右前翅相關參數的檢驗中，Levence變異數檢測中各參數的顯著性P值范圍為0.339～0.968。獨立樣本t檢驗顯著性P值范圍為0.268～0.991，各參數間差異也不顯著（圖2）。
　　2.2 雌雄成蟲左前翅在形態學參數上的差異
　　大多數情況下，進行鱗翅目昆蟲種類的鑒定，利用翅面特征只使用一側的翅表斑紋等。本文首先分析了雌雄成蟲左前翅形態結構特征，結果表明，Levene變異數相等測試表明各參數顯著性P值范圍為0.228～0.927，處理內各樣本間差異很小。獨立樣本t檢驗結果表明，左前翅面積（t=5.787，df=36，P<0.001）、短軸長度（t=8.977，df=36，P<0.001）、等效圓半徑（t=5.733，df=36，P<0.001）、偏心率（t=-7.966，df=36，P<0.001）、球狀性（t=5.420，df=36，P<0.001）和圓形度（t=6.843，df=36，P<0.001）在不同性別間差異達到極顯著水平，周長（t=2.641，df=36，P=0.012）和長軸長度（t=2.357，df=36，P<0.024）差異達到顯著水平，而緊湊度（t=1.335，df=36，P=0.190）和葉狀性（t=-0.664，df=36，P=0.511）在兩個性別間差異不顯著（圖3）。
　　2.3 雌雄成蟲雙側前翅形態學參數的差異
　　雖然同一性別成蟲左右前翅的形態特征在統計學上差異不顯著，可以簡單地推斷出左右翅基本對稱，但可以看出左右翅并不是完全對稱的，當左右翅混合使用時，這種微小差異是否會影響性別的最終判定需要做進一步的證明。因此，本文把每一性別左右翅數據重新組合成一個新的數據集，并進行了統計分析。結果表明，Levene變異數據相等測試顯著性P值范圍為0.076～0.788。獨立樣本t檢驗結果表明，雌雄兩性間翅面積（t=8.437，df=65，P<0.001）、周長（t=4.478，df=65，P<0.001）、長軸長度（t=4.385，df=65，P<0.001）、短軸長度（t=11.642，df=65，P<0.001）、等效圓半徑（t=8.513，df=65，P<0.001）、偏心率（t=-10.090，df=65，P<0.001）、球狀性（t=7.907，df=65，P<0.001）和圓形度（t=8.194，df=65，P<0.001）之間的差異均達到極顯著水平，而緊湊度（t=1.938，df=65，P=0.057）和葉狀性（t=-0.506，df=65，P=0.614）差異不顯著（圖4）。
　　2.4 雌雄判別結果
　　利用典型判別分析（canonical discriminant analysis）建立4個Fisher判別函數，在判別分析中用到3個。其中第1個函數的貢獻率為93.6%，第2個函數的貢獻率為4.7%。從最終的分類結果來看，會出現左右翅相互誤判現象。其中，左前翅的分組正確率（86.85%）明顯高于右前翅（67.55%）。但雌雄兩性間無誤判現象（100.00%），其分組散布圖如下（圖5）。
　　2.5 翅脈交叉點空間位置變化
　　通過普氏疊加和相對扭曲分析發現，所研究的樣本無論是雌性或是雄性，翅脈交叉點在翅膀橫向上的變化較大，且外圍兩個翅脈交叉點變異最大。通過相對扭曲分析，絕大部分樣本翅脈內部交叉點的變異不大，有部分樣本（雌性5個，雄性4個）存在較大變異。雌雄作為兩個數據集進行分析時，差異變化最大的翅脈交叉點為標號5和6兩個點（圖6）。
　　3 結論與討論
　　通過上述分析，本研究認為重陽木斑蛾成蟲左右前翅在輪廓特征上無顯著差異，雌雄間存在顯著差異。其中，僅利用左前翅的10個輪廓特征參數進行比較時，翅面積、短軸長度、等效圓半徑、偏心率、球狀性和圓形度在兩個性別間的差異達到極顯著水平，周長和長軸長度的差異達到顯著水平，而緊湊度和葉狀性的差異不顯著。利用兩側前翅的數據集時，除緊湊度和葉狀性的差異不顯著外，其余參數均達到極顯著水平。雖然利用左前翅的數據集在進行判別分析時分組正確率達到86.85%，且顯著高于右前翅的正確率（67.55%），存在左右翅誤判的情況，但整體數據集對雌雄無誤判現象。雌性或雄性個體間在翅脈交叉點空間位置上的變化多發生在相對于翅的橫向方向，且外緣附近的變異更大。
　　在研究過程當中，最初使用未去除鱗片的翅，但在圖像獲取時鱗片容易脫落，污染背景，且無法準確獲取翅脈交叉點位置，利用化學方法去除鱗片[20]是獲取鱗翅目昆蟲翅脈的關鍵一步。但這種方法的缺點是只適用于普通昆蟲標本，而對于珍稀標本，建議使用其他非破壞性操作方法，如微型計算機斷層成像技術（microcomputed tomography）[21]等。
　　本研究結果認為從前翅的輪廓特征來看，同一性別個體間無顯著差異，僅利用這些特征可以對重陽木斑蛾成蟲進行雌雄區別，并且可以左右翅相互替換。從實際的測量值（平均值±標準誤）來看，雌雄間雙側前翅的面積[♀：（227.92±4.085）mm2;♂：（185.23±2.84）mm2]、周長[♀：（84.26±1.24）mm;♂：（77.41±0.85）mm]、長軸長度[♀：（27.19±0.28）mm;♂：（25.56±0.24）mm]、短軸長度[♀：（11.35±0.11）mm;♂：（9.77±0.08）mm]、等效圓半徑[♀：（8.51±0.08）mm;♂：（7.67±0.06）mm]存在顯著差異，在這些指標上雌性大于雄性，這支持了參考文獻[46]中的描述。 　　而從翅脈交叉點的空間分布來看，不但雌雄間存在較大差異，同一性別不同個體間也存在顯著差異，主要表現在相對于翅的橫向方向的變化，并且靠近外緣的翅脈交叉點位置變化大。許多標本中會出現翅脈交叉點位置缺失或多出，因此所選翅脈交叉點相對位置有很大變化。據報道，在一些膜翅目和雙翅目昆蟲中，翅脈交叉點位置的相對變化是評價其不同亞種或近似種的重要依據[11， 2223]。而在一些水生昆蟲中，不良的環境條件和殺蟲劑很可能影響到昆蟲左右對稱性[24]。本研究采集標本之前，采集地從未使用殺蟲劑進行防治，基本可以排除殺蟲劑對重陽木斑蛾成蟲翅形的影響。根據相關報道，鱗翅目昆蟲翅脈交叉點的空間變異，可以用于區別不同夜蛾科昆蟲[19]，但是否適用于所有鱗翅目或其他種類的昆蟲，能否形成適合絕大多數昆蟲的標準化數據庫，這些還需要做進一步的研究。
　　在鱗翅目昆蟲的飼養和應用當中，尤其是對蝴蝶雌雄的判別方面，除了專業的分類人員可以通過生殖器結構、體和翅正反面彩色鱗片和鱗毛的差異等特征進行鑒別外，大部分工作人員很難準確判斷。對于研究中的重陽木斑蛾成蟲來說，雌雄間除了翅的形態特征可用于數字化鑒定外，通過腹末生殖節形態也可以做出較準確的判斷。一般情況下雌性產卵器為管狀外伸，而雄性腹部末端較平截（圖1）。另外，雌蟲腹部成對的黑斑多相連，而雄性腹部成對的黑斑多分離。但對于其他鱗翅目昆蟲來說，這些并不是穩定的鑒定特征。如果能夠通過翅的形態特征區別此類昆蟲的種類和雌雄，將有利于此類昆蟲的數字化鑒定，形成標準化的數據庫，推動鱗翅目或其他昆蟲種類的遠程鑒定功能。
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