PEG模擬干旱脅迫對水稻抗氧化酶基因表達的影響

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　　摘 要：【目的】干旱是影響水稻生產的重要環境因素之一，在干旱條件下水稻植株體內會發生一系列的抗逆反應，其中參與防御反應的關鍵酶基因表達會發生明顯的變化。因此，本研究擬分析干旱脅迫處理后抗氧化酶類基因的表達變化，為進一步研究水稻抗旱機制提供理論參考?！痉椒ā坎捎觅|量體積比為0（CK）、18%、20%、22%、24%、26% 的聚乙二醇（PEG6000）對三葉一心期的秈稻航2號植株進行干旱脅迫處理，篩選適合處理秈稻航2號的PEG6000質量體積比;進一步采用PEG6000對航2號植株進行干旱脅迫處理，分別于處理0、2、4、8、12、24、48、72 h取樣;并用SYBR Green I熒光定量PCR（qRT-PCR）分析PEG6000處理不同時間段后植株中抗氧化酶類基因表達，包括過氧化氫酶（CATA、CATB、CATC）、過氧化物酶（POX5.1、POX1）、超氧化物歧化酶（plastidic Cu/Zn-SOD，cytosolic Cu/Zn-SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）基因的表達變化。【結果】根據表型觀察和植株存活率，篩選出秈稻航2號對PEG6000的耐受臨界質量體積比為22%;qRT-PCR結果表明PEG6000脅迫處理后9個基因的表達均出現上調，大部分基因表達都呈先上調后下調的趨勢，且一般PEG處理4 h之后基因表達出現較明顯上調，說明這些基因均不同程度地參與了PEG脅迫反應;其中，過氧化氫酶A基因（CATA）表達變化最顯著，處理8 h表達量上調至處理0 h的28倍。【結論】PEG6000脅迫處理后主要的抗氧化酶類基因表達發生了明顯的變化。
　　關鍵詞：水稻;聚乙二醇（PEG6000）;干旱脅迫;抗氧化酶基因;表達分析
　　中圖分類號：S 511文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）03-255-09
　　Abstract： 【Objective】Expression of antioxidant enzyme genes of rice in response to drought-stress was studied. 【Method】 Simulated drought conditions using PEG6000 on Indica rice Hang 2 were used for the experimentation. The plants at 3-leaf stage were initially treated with 0% （CK），18%，20%，22%，24% or 26% PEG6000 to determine the appropriate concentration for the subsequent test. Under the selected PEG6000 treatment level，plant samples were collected at 0，2，4，8，12，24，48 and 72 h for analysis. The expressions of antioxidant enzyme genes （i.e.，CATA，CATB and CATC），peroxidase genes （i.e.，POX5.1 and POX1），superoxide dismutase genes （i.e.，plastidic Cu/Zn-SOD and cytosolic Cu/Zn-SOD），ascorbate peroxidase gene （i.e.，APX），and glutathione reductase gene （i.e.，GR） of the rice plants were determined by qRT-PCR. 【Result】Based on the phenotype and survival rate of the rice plants in the preliminary test，22% PEG6000 was chosen for the simulation experiment. The results of qRT-PCR showed that all 9 genes were upregulated initially under the treatment but downregulated afterward. Most of the genes significantly upregulated 4 h after treatment showing a response of the genes to the stress. In particular，CATA exhibited a most significant change at 8 h which was 28 times of that at 0 h. 【Conclusion】The expression of antioxidant enzyme genes significantly reacted to the PEG6000 treatment.  
　　Key words：rice;PEG6000; drought stress; antioxidant enzymes genes; expression analysis
　　0 引言
　　【研究意義】水稻是我國第一大糧食作物，約占糧食總產量的40%，全國有60%以上的人口以大米為主食，水稻產量與國家糧食安全問題密切相關。水稻對水分要求高，干旱是水稻生產的主要限制因素，導致水稻生長發育受阻，造成嚴重減產[1]。因此，進行水稻抗旱分子機制及重要基因的表達調控等方面相關研究對提高水稻抗旱性具有重要意義。【前人研究進展】干旱脅迫會使植株出現葉片卷曲，氣孔閉合，體內CO2含量降低，光合作用減弱等級聯反應，引發植物體在滲透調節、酶保護體系、抗旱基因表達與遺傳特性等方面產生一系列的生理生化變化，從而使植物體內平衡的自由基穩態遭到破壞[2]。植物細胞的第一層防線——質膜透性的破壞會使細胞膜上合成的過氧化產物（丙二醛，MDA）含量升高，同時植物體內容易產生大量的活性氧（ROS），包括超氧陰離子（O-2）、過氧化氫（H2O2）、單線態氧（1O2）和羥自由基（OH-）等[3]。過量的活性氧會造成生物膜的過氧化損傷，使得細胞器受損害，并造成DNA和蛋白質等的降解，最終導致膜整體結構瓦解和細胞死亡[4]。在干旱刺激下，植物首先會通過激活自身的酶系統進行協調運作以避免細胞內ROS的過分積累而傷害細胞膜。研究表明，植物體內的酶促系統對活性氧的清除起著舉足輕重的作用，此酶促系統中包含的抗氧化酶包括過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxisome，POX）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）等[5-7]。過氧化氫酶（CAT）是植物抗氧化防御系統的關鍵酶之一，其作用是把H2O2分解成水和氧氣;在水稻中包含3種同工酶CATA、CATB、CATC，它們均參與H2O2的分解[8-10]。過氧化物酶（POX）也是維持植物細胞正常生理活動的保護酶，是一種含血紅素的糖蛋白，催化H2O2和各種還原劑的氧化還原反應（H2O2+AH2→2 H2O+A）[11];水稻中已被鑒定的POX基因有22種[12]。超氧化物歧化酶（SOD）能清除植物體內多余的超氧陰離子（O-2），使O-2發生歧化反應生成H2O2和O2，H2O2可通過其他相關的抗氧化酶進行清除;根據其輔基部位所結合的金屬離子的不同，植物中主要有3種超氧化物歧化酶（SOD），包括銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）、錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）[13];其中，水稻基因組中包含4個銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因[14]。抗壞血酸過氧化物酶（APX）是以抗壞血酸鹽為電子供體，將H2O2還原為H2O和O2;在水稻中包含有8種APX同工酶基因[15]。谷胱甘肽還原酶（GR）是在NADPH的參與下將氧化型谷胱甘肽（GSSG）催化生成還原型谷胱甘肽GSH，后者再在清除過氧化物和過氧化氫中起作用[16];水稻中已被鑒定出來的谷胱甘肽還原酶（GR）有3種[17-18]。【本研究切入點】上述抗氧化酶在植物抗逆過程中起著重要作用，但相關基因的表達調控是復雜的，而且不同基因對逆境的響應程度也不盡相同，因此明確干旱脅迫下抗氧化酶基因的表達模式很有必要?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用PEG6000脅迫處理模擬干旱脅迫，首先篩選處理秈稻航2號的PEG6000臨界濃度;并采用qRT-PCR詳細分析PEG6000模擬干旱脅迫處理不同時間后相關抗氧化酶基因表達，獲得相應的表達模式，為采用PEG6000模擬干旱脅迫研究水稻的抗旱分子機制提供理論參考。 　　1 材料與方法
　　1.1 試驗材料
　　取當年收獲的秈稻航2號種子，室內浸種、催芽，后移至Yoshida水稻營養液，在28℃培養箱（16 h光照/24 h）中培養至三葉一心期，用聚乙二醇（PEG6000）模擬干旱脅迫處理。
　　1.2 主要試驗試劑
　　PEG6000購自Sigma公司;植物總RNA提取試劑Trizol購自全式金生物技術有限公司;cDNA鏈反轉試劑盒（RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit）購自Fermentas公司;2×Power Pfu PCR MasterMix購自北京百泰克生物技術有限公司;熒光定量試劑Rox Reference DyeⅡ（50×）購自羅氏（Roche）公司。
　　1.3 試驗方法
　　1.3.1 PEG6000處理植株
　　用Yoshida水稻營養液分別配制質量體積比為18%、20%、22%、24%、26%的PEG6000處理液，以Yoshida水稻營養液（即不含PEG6000）作為對照（CK），將三葉一心期的航2號植株于上述溶液中進行處理，每個處理3次重復，期間觀察植株表型并拍照。處理7 d后將所有植株轉移至營養液中恢復生長，8 d后統計植株存活率，篩選秈稻航2號的PEG6000處理臨界值。之后用PEG6000對另一批三葉一心期的航2號植株進行處理，分別于處理0、2、4、8、12、24、48、72 h取整植株（包括根莖葉），將植株沖洗干凈，并于-80℃保存，用于后續植株總RNA的提取。
　　1.3.2 水稻植株總RNA的提取和cDNA一鏈的合成
　　采用Trizol法提取水稻植株總RNA：樣品于研缽中，用液氮研磨成粉末并迅速裝入1.5 mL的EP管中，立即加入1 mL Trizol試劑，搖勻;于冰上靜置10 min，加入200 μL氯仿，混勻;冰上靜置10 min，12 000 r·min-1離心15 min;取上清，加入等量異丙醇，混勻;冰上靜置10 min，12 000 r·min-1離心10 min;棄上清，用75%乙醇洗2次;晾干，并加入適量ddH2O溶解，進行瓊脂糖凝膠電泳分析并測定OD值以檢測所提RNA質量。
　　按照RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit的操作說明書，反轉錄合成cDNA一鏈，并稀釋20倍，于-20℃保存，用于后續RT-PCR和熒光定量PCR（qRT-PCR）試驗。
　　1.3.3 引物設計
　　從NCBI數據庫中下載相關基因序列，GenBank編號具體如下：過氧化氫酶A基因（CATA），EF371902.2;過氧化氫酶B基因（CATB），DQ078758.1;過氧化氫酶C基因（CATC），DQ118681.1;過氧化物酶5基因（POX5.1），AF014469.1;過氧化物酶1基因（POX1），DQ855429.1;質體銅/鋅超氧化物歧化酶基因（plastidic Cu/Zn-SOD），D85239.1;細胞質銅/鋅超氧化物歧化酶基因（cytosolic Cu/Zn-SOD），L36320.1;抗壞血酸過氧化物酶基因（APX），D45423.1;谷胱甘肽還原酶基因（GR），GQ420382.1;內參基因，真核起始因子（eIf4a），AK073620;內參基因，肌動蛋白基因（Actin150），AK100267。采用primer5.0軟件設計相關引物，詳細信息如表1。1.3.4 RT-PCR
　　為了檢驗引物的擴增效果，以上述反轉錄的PEG6000處理0 h（即PEG處理前）的樣品cDNA一鏈為模板，用相關基因引物進行RT-PCR擴增，反應體系：2×Power Pfu PCR MasterMix 5 μL，上下游引物F/R（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補足至10 μL。RT-PCR反應程序：94℃預變性5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，30個循環;72℃ 延伸7 min。反應完成后，取3 μL RT-PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
　　1.3.5 熒光定量PCR（qRT-PCR）
　　選擇水稻肌動蛋白基因Actin150為內參基因，進行SYBR Green I熒光定量PCR，反應體系：Rox Reference DyeⅡ（50×） 10 μL，目的基因上游引物F/Actin 150 F （10 μmol·L-1） 0.6 μL，目的基因下游引物R/Actin 150 R （10 μmol·L-1） 0.6 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補足至10 μL。每個反應設4次重復，采用ABI7500熒光定量PCR儀，反應程序：95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環;反應結束后進行熔解曲線分析，熔解曲線根據ABI7500儀器標準程序進行。導出相關數據，并采用Microsoft Excel 2016進行作圖分析。
　　2 結果與分析
　　2.1 不同干旱脅迫程度對水稻生長的影響
　　不同質量體積比PEG6000營養液對水稻生長的影響見圖1。處理0 h（即處理前），所有植株生長一致（圖1-A）。處理3 h，與CK相比，含18%和20% PEG6000營養液中的大部分水稻植株葉片已蜷曲，20% PEG6000營養液中水稻葉片蜷曲更明顯;22%、24%、26% PEG6000營養液中水稻植株葉片已全部蜷曲（圖1-B）。處理24 h，CK植株保持正常生長，含18%和20% PEG6000營養液中的水稻植株葉片蜷曲但植株保持直立;而22%、24%、26% PEG6000營養液中水稻植株已開始出現萎蔫（圖1-C）。處理48 h情況與24 h時類似，并且22%、24%、26% PEG6000營養液中水稻植株萎蔫明顯（圖1-D）。處理72 h，22%、24%、26% PEG6000營養液中水稻植株萎蔫更加明顯（圖1-E）。處理96 h，含PEG6000營養液中水稻植株變黃，且22%、24%、26% PEG6000營養液中水稻植株絕大部分已脫水枯萎（圖1-F）。處理5、6、7 d情況類似，CK植株保持正常生長，含18%和20% PEG6000營養液中的水稻植株生長較CK植株緩慢，部分葉片變黃，其余葉片卷曲且保持綠色;22%、24%、26% PEG6000營養液中水稻植株絕大部分已明顯脫水枯萎（圖1-G）。處理7 d后將所有植株于營養液中恢復生長，恢復生長8 d，統計植株存活情況;與CK相比，18% PEG6000處理過的植株生長較緩慢且出現較多的枯葉，但所有的植株都存活，存活率100%;20% PEG6000處理的情況與前者類似，所有植株存活，存活率100%;22% PEG6000處理過的植株只有3株恢復生長，存活率為12%;24%和26% PEG6000處理過的植株沒有恢復生長，存活率為0（圖1-H、表2）。以上結果表明，22%的PEG6000是秈稻航2號對PEG6000耐受的臨界值，小于22%植株基本存活，而大于22%植株全部脫水枯萎。因此，后續試驗采用22% PEG6000對植株進行處理。2.2 22% PEG6000處理植株及cDNA的合成 　　將三葉一心期的水稻植株于含22% PEG6000的營養液中進行處理，分別在處理0、2、4、8、12、24、48、72 h取樣。采用Trizol法提取樣品總RNA。從圖2可看出擴增條帶清晰，28 S和18 S條帶明顯，說明所提取的RNA完整。分別取每個處理1 μg RNA樣品進行反轉錄，并用內參引物Actin150F/R和eIf4aF/R進行RT-PCR。結果顯示均可擴增出單一的亮條帶，并且條帶亮度一致（圖3）;說明cDNA質量較好且各樣品濃度一致，可用于后續的試驗。
　　2.3 抗氧化酶基因的RT-PCR擴增
　　根據NCBI數據庫中登錄的過氧化氫酶（CATA、CATB、CATC），過氧化物酶（POX5.1、POX1），銅/鋅超氧化物歧化酶（plastidic Cu/Zn-SOD、cytosolic Cu/Zn-SOD），抗壞血酸過氧化物酶（APX），谷胱甘肽還原酶（GR）基因序列設計引物，以PEG6000處理前的樣品cDNA為模板進行RT-PCR。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示（圖4），樣品中均可擴增出以上基因的相關片段，且條帶單一，說明所用引物擴增效果良好，并且由于基因表達量不同相應引物所擴增出的條帶亮度不一樣。
　　2.4 22% PEG6000處理水稻抗氧化酶基因表達變化
　　采用qRT-PCR分析22% PEG6000處理0、2、4、8、12、24、48、72 h后植株中過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶基因的表達變化。
　　2.4.1 過氧化氫酶基因的表達分析
　　結果顯示，22% PEG6000處理后過氧化氫酶A基因（CATA）的表達量變化明顯，處理2 h時稍微增加，處理4 h表達量是0 h的2倍;處理8h表達量達到最高，約為0 h的28倍，處理12 h表達量降低至0 h的11倍，而處理24 h后迅速降至處理前水平（圖5-A）。過氧化氫酶B基因（CATB）的表達量在22% PEG6000處理2 h時稍微增加，處理4 h表達量迅速增加約為0 h的12倍，并繼續增加，處理12 h達到最高，為0 h的17倍;處理24 h該基因的表達量下降至0 h的11倍，處理48 h表達量迅速下降至0 h的1.9倍，處理72 h表達量稍微提高至0 h的2.5倍（圖5-B）。與前面兩種過氧化氫酶基因不同，22% PEG6000處理后過氧化氫酶C基因（CATC）的表達量變化不明顯，只稍微有所增加，處理72 h表達量達到最高也僅為0 h的1.8倍（圖5-C）。
　　2.4.2 過氧化物酶基因的表達分析
　　22% PEG6000處理后過氧化物酶5基因（POX5.1）的表達量先下降，處理2 h表達量為0 h的一半，處理4 h該基因的表達量為0 h的67%左右;處理8 h和12 h表達量分別增加為0 h的2倍和5倍，處理24 h表達量最高為0 h的10.5倍，處理48 h表達量迅速降低至0 h的1.7倍，而處理72 h其表達量又提高為0 h的5倍（圖5-D）。過氧化物酶1基因（POX1）的表達量呈先上升后下降的趨勢，處理2 h表達量稍微增加，處理4 h達到最高為0 h的5倍，接著開始逐漸降低，處理8、12、24 h其表達量分別為0 h的4.3倍、3.3倍和2.4倍，而處理48h和72 h表達量均低于0 h（圖5-E）。
　　2.4.3 銅/鋅超氧化物歧化酶基因的表達分析
　　22% PEG6000處理后質體銅/鋅超氧化物歧化酶基因（plastidic Cu/Zn-SOD）表達量稍有上調，但變化不明顯，處理48 h表達量達到最高，僅為0 h的2倍（圖5-F）。與前者相比，細胞質銅/鋅超氧化物歧化酶基因（cytosolic Cu/Zn-SOD）表達變化較明顯，處理2 h表達量稍微上調，處理4 h增加至0 h的3.7倍，后隨處理時間的延長逐漸降低，處理72 h表達量為0 h的1.6倍（圖5-G）。
　　2.4.4 抗壞血酸過氧化物酶基因的表達分析
　　22% PEG6000處理后抗壞血酸過氧化物酶基因（APX）的表達量增加，處理2 h其表達量約為0 h的2倍，處理4、8、12 h表達量維持在0 h的4.5倍左右，24 h表達量達到最高約為0 h的6.6倍，處理48 h下降至0 h的3倍，而處理72 h表達量又升高至處理24 h的水平，為0 h的6.3倍（圖5-H）。
　　2.4.5 谷胱甘肽還原酶基因的表達分析
　　22% PEG6000處理后谷胱甘肽還原酶基因（GR）的表達量變化明顯，處理2 h稍微上調，處理4 h表達量迅速增加至0 h的12倍，隨后降低，處理8、12、24 h其表達量分別為0 h的9.3倍、8.8倍和5.7倍;處理48、72 h表達量降至0 h的2倍左右（圖5 -I）。
　　3 討論與結論
　　聚乙二醇（PEG）處理是研究作物抗旱性方法之一，也是較為常用的方法，此方法簡單易行，條件容易控制，重復性好，試驗周期短，適用于大批量材料的苗期抗旱性鑒定[19]。常用來模擬干旱脅迫處理的PEG質量體積比為20%，但不同水稻品種對PEG6000的耐受力不同。本研究用不同質量體積比的PEG6000處理秈稻航2號三葉一心期植株，根據恢復生長后植株存活情況發現秈稻航2號對PEG6000耐受的臨界質量體積比為22%，這可為采用PEG處理研究秈稻品種的抗旱性提供參考。
　　在生理生化方面，有研究表明用15%PEG處理后遼星1號水稻植株中SOD同工酶和POD同工酶活性升高，并誘導出新的相應同工酶參與抗氧化過程;同時，隨著PEG脅迫時間的增加CAT同工酶活性也增加[20]。另外，PEG脅迫處理0、2、4、6 d后水稻植株中SOD和POD的活性均隨PEG脅迫時間的延長呈上升趨勢，CAT活性則呈先上升后下降的趨勢[21]。而有研究則表明隨著20%PEG脅迫處理時間的增加水稻植株中SOD的活性呈現先迅速上升后急劇下降的趨勢[22];張小娟等的研究也表明PEG脅迫處理后SOD的活性先上升后下降[23]。相應地，在基因表達方面，15%PEG脅迫處理后植株中Cu/Zn-SOD、APX1 和CAT1 基因在轉錄水平有明顯的上調[20]。而本研究的qRT-PCR分析表明，PEG處理后秈稻航2號植株中過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POX）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）基因的表達大部分都呈現先上升后下降的趨勢，并且一般PEG處理4 h之后基因表達才出現較明顯的上調，說明它們均不同程度地參與了PEG脅迫反應。另外，本研究還發現不同家族基因的表達受影響的程度不同，并且同一家族中不同基因的表達受影響的程度也不同;如PEG處理后過氧化氫酶基因家族中的過氧化氫酶A基因（CATA）表達變化顯著，而過氧化氫酶C基因（CATC）變化并不明顯;再如同一家族基因中的細胞質銅/鋅超氧化物歧化酶基因（cytosolic Cu/Zn-SOD）的表達也出現了較明顯的變化，但質體銅/鋅超氧化物歧化酶基因（plastidic Cu/Zn-SOD）的表達變化不明顯。較為特別的是，與其他基因不同，過氧化物酶5基因（POX5.1）的表達在PEG處理2 h和4 h時出現下調，PEG處理8 h才開始出現上調，即該基因的表達在PEG處理后出現先下調后上調而后又下調。這很可能是由于不同基因的表達受調控的機制不一樣所導致的。 　　當水稻受干旱脅迫時，會出現一系列的自我防御機制，許多抗氧化酶包括過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POX）、超氧化物歧化酶（SOD）等將參與其中。本研究說明相關抗氧化酶類基因的表達均受PEG模擬干旱脅迫的誘導，并獲得其表達模式，為水稻相關的抗旱分子機制研究奠定了一定的理論基礎。
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