抗蟲轉基因水稻檢測技術研究綜述

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　　摘  要：近年來，隨著抗蟲轉基因水稻研究的進一步發展，世界各地實驗室在抗蟲轉基因水稻研究方面均有收獲，抗蟲轉基因水稻檢測隨之成為眾多科學家的關注點。該文綜述了抗蟲轉基因水稻檢測技術的研究進展，為進一步開展轉基因水稻檢測的研究工作提供參考。
　　關鍵詞：抗蟲 Tail-PCR;轉基因水稻;基因芯片;檢測技術
　　中圖分類號  S511 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）10-0015-04
　　稻米是全世界近一半人口消費的主要糧食作物，對于人類的生存和發展起著極其重要的作用，是我國食用人口比重最大的糧食作物。研究表明，當前制約水稻穩產、高產以及稻米品質的主要是各類害蟲，所以防治蟲害成為了重中之重。在防治害蟲時，使用生物防治手段，不僅制約因素多、還不易控制，而使用化學農藥不僅破壞生態平衡、還可以使螟蟲產生抗性;培育抗蟲水稻新品種，增強水稻的抗蟲性，是一種更經濟環保的方法。然而，傳統的抗蟲水稻育種周期長，有限的遺傳資源，不明確的抗蟲機制，還會產生新的生物型害蟲，導致抗蟲性不穩定，極大地制約了水稻抗蟲育種的進程。因此，利用基因工程技術獲得轉基因抗蟲水稻，是水稻防蟲侵害的最有希望和前途的方法。
　　1 抗蟲轉基因水稻簡介
　　抗蟲轉基因水稻就是利用轉基因技術將抗蟲基因導入水稻的受體細胞中，使寄主在水稻細胞內抗蟲基因得到表達并遺傳，使水稻自身產生抗蟲蛋白，進而形成抗蟲的新型水稻品種。在水稻轉基因抗蟲研究中，被廣泛應用的水稻抗蟲基因是從蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中發現的Bt基因。1989年，人類第一次培育轉基因水稻植株，此植株是由中國農業科學院楊虹等將Bt基因利用原生質體電融合技術導入粳稻臺北309的基因組DNA中培育出的新型水稻[1]?，F至今已有多個實驗室成功培育出轉基因水稻新品種。金永梅等[2]將 Cry1C*、 Cry2A*這2個不同的Bt抗蟲基因利用農桿菌介導法同時導入到水稻品種吉粳88中去，獲得了二價抗蟲轉基因水稻。2005年華中農業大學張啟發院士課題組，將水稻Actin啟動子驅動的融合型Bt抗蟲基因cry1A（b）/cry1A（c）導入秈型恢復63中，得到了一些基本不用藥物防治螟蟲危害的轉化植株[3]。2009年底，2個由華中農業大學研發的抗蟲轉Bt基因水稻“華恢1號”和“Bt汕優63”，首次獲得農業部為轉基因水稻頒發的安全證書，標志著轉Bt基因水稻以成功進入中國。2015年1月5日，“轉基因抗蟲水稻“再次獲得由農業部頒發的農業轉基因生物安全證書（生產應用），2018年，轉基因抗蟲水稻華恢1號獲得美國FDA的商業化許可。2002年，我國農業部和衛生部同時發布了《農業轉基因生物標識管理辦法》、《轉基因食品衛生管理辦法》2部法規，內容規定強制進行轉基因食品標識[4-5]。表明抗蟲轉基因水稻的培育和應用需要轉基因水稻的檢測技術。就轉基因基因檢測技術來說，發達國家技術水平高于發展中國家，美國等發達國家向發展中國家出口了大量抗蟲轉基因產品。中國已經加入了WTO，必然面臨著轉基因產品貿易和安全監控的挑戰[6-8]。
　　2 抗蟲轉基因水稻檢測技術研究進展
　　抗蟲轉基因水稻檢測主要內容是檢測抗蟲基因（Bt基因）是否存在以及含量，還要確定其是否能成為合格的轉基因新品種等[9]。隨著科技的不斷發展，植物基因工程技術領域里不斷研究出新的轉基因植物檢測技術，檢測范圍發展到DNA水平、RNA水平和蛋白質水平3個方向。檢測方法主要有PCR檢測方法、Souther雜交、Tail-PCR、基因芯片、RT-PCR檢測、實時熒光定量PCR檢測、Nouther雜交、ELISA方法、試紙條檢測法等。
　　2.1 蛋白質水平檢測
　　2.1.1 ELISA檢測法 通過歐洲多個實驗室研究結果可以確定，運用ELISA方法檢測Bt蛋白含量結果可信度幾乎達到100%，目前普遍應用ELISA檢測法檢測抗蟲轉基因水稻Bt蛋白含量。2018年黑龍江大學李榮田等使用ELISA方法檢測出不同Bt基因在植物細胞蛋白質層面的表達量（或最高表達量）是有差別的[10]。ELISA檢測法是通過實驗結果是否發生顏色反應及生成物質顏色變化的深淺來判定檢測信號的存在和含量的?？瓜x轉基因水稻表達的目標蛋白（抗原）和抗體存在特異性反應，結合了酶和底物之間高效催化作用，也就是說加入酶催化底物后，底物就會發生反應并且生成有顏色的物質，酶含量和生成物質顏色深淺呈正比，間接顯示了目標蛋白含量的多少。因此，ELISA檢測法即可以定性檢測抗蟲基因是否存在，也可以定量分析抗蟲基因表達量[11]。該方法現在已經推廣試劑盒的應用，可快速實驗并且準確度高。
　　2.1.2 試紙條法 試紙條法是將含有特異抗體的蛋白提取液交聯到試紙條和有顏色物質上，當紙上抗體和蛋白提取液中特異抗原結合之后，再與特異的帶有顏色的抗體進行反應，于是就在試紙條上出現了三明治狀的色帶。假如沒有抗原，就沒有三明治色帶。中國科學院王彤彤[12]采用快速檢測試紙條，僅僅需要5min就可以準確測定出抗蟲轉基因水稻中Bt蛋白含量。由此可見，試紙條法可以在現場進行檢驗或初篩時，不需特殊的儀器設備就可以完成實驗，將來有著較好的應用前景。
　　2.2 RNA水平檢測
　　2.2.1 半定量RT-PCR檢測 這是一種通過檢測特異性mRNA的靈敏度來分析基因表達的快速方法。此方法首先提取抗蟲轉基因水稻總RNA，然后以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA;再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達產物，最后通過限制性內切酶酶解或者核苷酸測序來進一步鑒定PCR產物[13]。半定量RT-PCR技術雖然快速簡便，但是它是一種粗略的估計基因表達量的方法，若要精確計算基因表達量，還需要定量PCR技術。 　　2.2.2 實時熒光定量PCR檢測 實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統PCR中不能定量檢測的局限性，其原理是在普通PCR反應中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，然后通過標準曲線就可以對未知模板進行定量分析[14]。中國農業科學院蘇長青博士建立了轉基因抗蟲水稻科豐8號實時熒光定量PCR檢測方法，并用此方法確定了科豐8號品系外源抗蟲基因為10拷貝[15]。因此，實時熒光定量PCR技術是外源基因定性定量分析先進技術，其優勢在于準確性高、假陽性低、特異性好、靈敏度高。因為應用熒光信號檢測對樣品初始模板濃度進行定量，能夠使結果誤差小;過程中操作簡單、自動化程度高;整個反應在閉管條件下一步反應完成，既不會交叉污染，更保護了實驗環境[16]。
　　2.2.3 Northern雜交 Northern雜交是一種通過檢測RNA的表達水平來檢測外源抗蟲基 因表達的方法。假如整合到水稻染色體上的外源抗蟲基因能正常表達，那么轉化水稻植株細胞內有其特異轉錄產物生成。首先，將提取的植物總RNA用變性凝膠電泳分離;然后，將凝膠上不同排布的RNA分子按照原位轉移到固定膜上，在適宜的離子強度及溫度條件下，特異性標記的探針會與膜上的同源序列進行雜交;最后，通過探針的標記性質就可以檢測出雜交體，而且轉錄的特異性RNA分子量的大小可以直接通過雜交體在膜上的位置來判斷。若無雜交，樣品無雜交帶出現，表明外源基因已經整合到水稻細胞染色體上，只是外源抗蟲基因在某些部位和特定生理狀態下并未有效表達，不能說明外源基因不表達，需要接下來的實驗進一步判斷[17]。
　　2.3 DNA水平檢測
　　2.3.1 簡單PCR技術 簡單PCR技術是抗蟲轉基因水稻外源基因檢測最成熟、基礎的一項檢測。黃曉西[18]運用簡單PCR技術檢測了轉新型Bt基因抗蟲水稻146株，轉化率達32.8%。其原理是體外利用極少量DNA模板酶促合成特異DNA片段，設計特異性引物，添加催化DNA聚合酶，經過高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等反應組成一個周期，循環進行，達到目的基因片段快速擴增的過程。簡單PCR技術只能滿足一種或少數幾個轉基因品種的檢測需要，并且檢測結果一旦出現假陽性的缺陷，就會導致工作程序重復驗證，耗費大量時間，現在除簡單的定性鑒定之外，已不能滿足當前工作中快速通關的要求。
　　2.3.2 多重PCR技術 多重PCR技術是在常規PCR基礎上發展出能夠同時擴增多個核算片段的一種新型PCR技術。在應用時要求使用至少兩對熔解溫度相近、彼此不發生相互作用的2隊引物，并且擴增產物分子量大小即相近又能通過電泳分離。反映到植物基因工程應用，水稻中的內參基因、外源基因、355啟動子、NOS終止子可以在同一個PCR體系中同時用多套引物分別擴增出來。敖金霞[19]建立了適用轉基因大豆、玉米和水稻深加工產品定性檢測的5重巢式PCR檢測方法，其檢測靈敏度為0.005%。此方法簡化了操作程序，既節省了模板DNA，又減少費用，是一種非常有發展前景的定性PCR檢測方法[20]。
　　2.3.3 Southern Blot雜交 Southern Blot通常被用來鑒定外源基因在抗蟲轉基因水稻中的整合情況，即檢測抗蟲基因整合在水稻基因組中的拷貝數情況。其基本原理是首先用限制性內切酶將水稻基因組酶切消化，標記目的基因片段為探針備用，然后將消化的基因組DNA與標記好探針在雜交膜上進行雜交，包含目的基因的基因組片段與探針會因為發生同源重組而顯示雜交信號，目標基因拷貝數就自然得出。因此，金永梅[21]等利用Southern Blot技術檢測出單拷貝抗蟲水稻植株，以此為前提，確定出外源抗蟲基因的插入位點。該技術雖然操作程序復雜，周期長和成本高，但是因其高度準備性，因此一直以來都被認為是篩選陽性轉基因植株最為可靠、穩定的方法[22-24]。
　　2.3.4 Tail-PCR Tail-PCR是可以確定外源抗蟲基因它插入水稻基因組位置的技術。吉林省農業科學院金詠梅馬瑞等利用Tail-PCR方法，將轉cry1C基因抗蟲水稻吉生粳3號的左、右邊界旁側序列，依據旁側序列確定T-DNA在基因組中的插入位點，并建立吉生粳3號品系特異性 PCR方法。利用農桿菌遺傳轉化方法導入的外源抗蟲基因在宿主水稻基因組的插入位點是隨機的，每個轉化事件中外源抗蟲基因和水稻基因組DNA拼接組成的旁側序列具有唯一性。T-DNA整合過程是一個復雜的異常重組過程，包括水稻基因組整合位點的刪除和重復，T-DNA序列的刪除和重復，以及水稻染色體上的易位和到位等現象。染色體步移（Chromosomewalking）是指從生物基因組或基因組文庫中的已知序列出發，逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關系的目標序列的方法。分離旁側序列的染色體步移方法主要采用染色體步移技術中的半隨機引物PCR策略。半隨機引物PCR策略中的熱不對稱交錯PCR（Tail-PCR）是將目標序列旁的已知序列中設計的3個嵌套的特定引物（specialprimerSP1，SP2，SP3）分別與1個具有低Tm值的隨機簡并引物相結合，根據引物的長短和特異性的差異設計不對稱的溫度循環，通過分級反應來擴增特異產物的方法。根據所分離的旁側序列，通過與NCBI 的比對分析確定T-DNA在基因組中的整合位點。該序列是不同轉基因作物品系的特異性身份標識，根據其建立的品系特異性檢測方法能快速、準確地鑒定不同的轉基因作物品系[25-26]。利用Tail-PCR技術檢測抗蟲轉基因水稻，保證了抗蟲轉基因水稻檢測的準確性和專一性，為監管抗蟲轉基因水稻的育種、生產、加工和銷售提供了可靠的技術支撐[27-28]。利用外源抗蟲基因在水稻基因組上整合位點的唯一性，可以建立抗蟲轉基因水稻品系特異性檢測方法，該方法可以根據外源抗蟲基因與旁側水稻基因組連接區序列為靶標設計引物，使用Tail-PCR方法擴增出對照和抗蟲轉基因品系特異的PCR條帶[29]。目前，我國抗蟲轉基因水稻安全試驗階段過程中，要求提供轉入外源抗蟲基因提供插入位點堿基序列。因此，Tail-PCR技術是轉基因抗蟲水稻商品化不可或缺的一項技術。 　　2.3.5 基因芯片 當常規的一些檢測方法需要操作繁瑣的轉膜、雜交等，費用高同時不能快速精準的檢測，有些方法更不適合大批量樣品的檢測。最近幾年發展起來一種專門用來檢測核酸的生物芯片，亦稱基因芯片，是多學科交叉融合產生的高新技術產品。基因芯片是利用核酸互補雜交原理研制的，其原理是在一塊固相支持介質表面固定已知序列的DNA/RNA片斷，形成DNA/RNA微矩陣，即核算探針;將熒光標記分子通過體外轉錄或擴增等技術摻入到樣品RNA或DNA當中，與位于微陣列上的已知DNA核酸探針序列雜交，通過熒光顯影法等對雜交信號強度進行檢測分析，獲得序列完全互補的探針序列，再用計算機軟件比較和綜合分析數據后，即可獲得樣品中分子數量和大量基因表達信息[30]。目前，將通用的報告基因、抗蟲基因、啟動子和終止子的特異片斷制成檢測芯片與待測產品的DNA進行雜交，雜交信號由掃描儀掃描后再經計算機軟件進行分析，就可以判斷待測樣品是否為抗蟲轉基因水稻。
　　3 小結與展望
　　轉基因抗蟲水稻檢測涉及到的檢測內容主要是蛋白質檢測和核酸檢測。蛋白質檢測主要利用抗原抗體特異性反應原理進行，實驗操作簡便、快速，結果準確可靠。在核算檢測方面，PCR技術經過不斷優化后，定性、定量檢測檢測范圍更廣，具有特異性好，靈敏度高等優點被廣泛使用。近年來發展的Tail-PCR技術，雖然建立在Southern Blot技術基礎之上，可是能夠定位抗蟲基因的位置，這在技術領域上是一大突破?；蛐酒夹g雖然成本高，數據分析復雜，但是其優勢在于高密度、高通量，用量少，快速而且準確。因此，今后轉基因檢測技術研究的發展趨勢必然是將各種檢測技術結合起來，建立更加高效、快速、便捷、高通量、低成本的新檢測方法。
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