KIF14在前列腺癌細胞中的表達及作用

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　　摘要：目的  研究驅動蛋白家族成員14（KIF14）在前列腺癌（PCa）細胞中的表達和對PCa細胞的生物學功能的影響。方法  采用RT-PCR檢測KIF14在PCa細胞系中的RNA表達情況。使用siRNA（siKIF14組或siControl組）分別敲減PCa癌細胞22Rv1，RT-PCR驗證敲減效率后，采用細胞計數、Transwell試驗分別檢測對兩側細胞增殖、遷移的影響。結果  KIF14在多種PCa細胞系中過表達;siKIF14組22Rv1細胞的 KIF14的mRNA水平相比siControl組降低，表達量下降達（88±2）%，差異有統計學意義（P<0.05）;在KIF14表達被敲減后，siKIF14組細胞增殖相比siControl組在24 h和48 h均降低，差異有統計學意義（P<0.05）;Transwell小室試驗檢測結果顯示，24h后，siKIF14組細胞遷移數（139.33±28.74）/每視野，較siControl組的（436.00±51.56）/每視野減少，差異有統計學意義（P<0.05）。結論  KIF14是潛在的癌基因，敲減KIF14表達可抑制PCa細胞的增殖與遷移，可能在PCa進展中發揮作用。
　　關鍵詞：驅動蛋白家族成員14;前列腺癌;癌基因;增殖
　　中圖分類號：R737.25                                文獻標識碼：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.09.022
　　文章編號：1006-1959（2019）09-0068-03
　　Abstract： Objective  To study the expression of kinesin family member 14 （KIF14） in prostate cancer （PCa） cells and its effect on the biological function of PCa cells. Methods  The expression of KIF14 in PCa cell line was detected by RT-PCR. PCR cancer cells 22Rv1 were knocked down by siRNA （siKIF14 group or siControl group）， and the knockdown efficiency was verified by RT-PCR. The effects of cell proliferation and migration were detected by cell counting and Transwell assay， respectively. Results  KIF14 was overexpressed in various PCa cell lines. The mRNA level of KIF14 in 22Rv1 cells of siKIF14 group was lower than that in siControl group， and the expression level decreased （88±2）%， the difference was statistically significant （P<0.05）. After KIF14 expression was knocked down， the cell proliferation of siKIF14 group was lower than that of siControl group at 24 h and 48 h，the difference was statistically significant （P<0.05）. The results of Transwell chamber test showed that after 24 h， the number of cell migration in the siKIF14 group （139.33±28.74）/per visual field was lower than that in the siControl group （436.00±51.56）/per visual field，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  KIF14 is a potential oncogene. Knockdown of KIF14 expression can inhibit the proliferation and migration of PCa cells， which may play a role in the progression of PCa.
　　Key words：Kinesin family member 14;Prostate cancer;Oncogene;Proliferation
　　前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的惡性腫瘤之一，在美國其發病率居第1位，也是男性癌癥死亡第2大原因[1]。近年來國內PCa發病率及死亡率逐年增高。部分PCa患者發現時已進展，失去手術機會，長期存活率不理想[2]。PCa發生、進展以及向激素非依賴轉變的分子機制目前仍不明確，通過研究其機制，嘗試在分子水平對其進行干預，是目前PCa研究領域的熱點和難點之一，更有效的治療策略及新靶點是該研究領域亟待解決的問題，對于PCa的防治具有重要意義。盡管在PCa中發現基因組改變方面取得了較大進展，但新的基因組生物標記和蛋白質仍有待鑒定。驅動蛋白家族蛋白（KIFs）是ATP-和微管相關的運動蛋白，參與細胞分裂，微管聚合物動力學，細胞內運輸和信號轉導[3]。驅動蛋白家族成員14（KIF14）含有C末端激酶結合區和調節胞質分裂結合區的N末端蛋白[4，5]，在雙極紡錘體形成過程中與染色質和微管結合[4-6]。KIF14表達上調可誘導快速且容易出錯的有絲分裂，導致腫瘤發生過程中的非整倍體形成[6]。雖然KIF14的確切分子功能仍在研究中，但多項證據表明KIF14是一種癌基因，其在包括肝細胞癌，胃癌，乳腺癌，膠質瘤和卵巢癌等多種類型的腫瘤中過表達[6-12]。此外，KIF14水平是肝細胞癌和卵巢癌獨立的預后因素，KIF14過表達促進腫瘤生長，而敲減會降低體外和移植瘤模型的致瘤性[13]。KIF14在PCa中的作用尚不明確，本研究將對KIF14在PCa細胞中的表達及其對PCa細胞的生物學功能的影響進行分析，現將結果報告如下。 　　1材料與方法
　　1.1細胞培養和轉染  PCa細胞系22Rv1購自ATCC。將細胞維持在含有10%胎牛血清（FBS），1%青-鏈霉素和2.5 mM谷氨酰胺的RPMI 1640培養基（Invitrogen）中，在37℃ 5%CO2條件下培養。KIF14-siRNA（siKIF14，Santa Cruz，sc-60882）和對照siRNA（siControl，Santa Cruz，sc-37007）購自美國Santa Cruz 生物技術公司。使用RNAiMAX轉染試劑（Invitrogen，13778）根據制造商的說明進行轉染。
　　1.2試驗方法
　　1.2.1 RNA提取、逆轉錄和定量實時PCR  用Trizol試劑提取RNA。正常前列腺RNA購自美國Clontech公司。隨機六聚體和SuperScript-Ⅲ（Invitrogen）進行逆轉錄。使用實時PCR Master Mix（SYBR Green）通過Applied Biosystems 7300實時系統進行實時定量PCR。標準曲線用于建立擴增效率[14]，每個實驗一式三份，重復3次，使用的所有引物見表1。
　　1.2.2生長曲線  將22Rv1細胞以適當的密度接種在6孔板中，分別用對照siRNA或siKIF14轉染細胞。轉染后，每24 h計數細胞數，包括起始點。每個實驗一式三份，重復3次。
　　1.2.3 Transwell試驗  在24孔板中用siRNA轉染后，使用Transwell小板（8 μm孔徑）評估細胞遷移。在上室中加入含無血清培養基的22Rv1細胞，在下室加入10%FBS培養基，24 h后在顯微鏡下在至少3個下室隨機區域中計數細胞數。結果從至少3次獨立實驗中獲得。
　　1.3統計學分析  所有數據采用SPSS 11.5軟件包進行分析。計量資料表示為（x±s）。各組間數據的比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01表示統計學意義顯著。
　　2結果
　　2.1 KIF14在PCa細胞中的表達情況  通過RT-PCR檢測PCa細胞系和正常前列腺組織中KIF14的mRNA表達發現，與正常前列腺組織相比，KIF14在LAPC4、22Rv1、LNCaP、DU145、PC3等多個PCa細胞中明顯上調（P<0.05），見圖1。
　　2.2敲減KIF14對PCa細胞增殖的影響  在用siRNA轉染48 h后，RT-PCR分析顯示，siKIF14組22Rv1細胞的 KIF14的mRNA水平相比siControl組降低，表達量下降達（88±2）%，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2A。在KIF14表達被敲減后，siKIF14組細胞增殖相比siControl組在24 h和48 h均降低，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2B。這表明敲減KIF14抑制可PCa細胞的增殖。
　　2.3敲減KIF14對PCa細胞遷移的影響  Transwell小室試驗檢測結果顯示，24 h后，siKIF14組細胞遷移數（139.33±28.74）/每視野，較siControl組的（436.00±51.56）/每視野減少，差異有統計學意義（P<0.05），這表明敲減KIF14抑制可PCa細胞的遷移，見圖2C。
　　3討論
　　腫瘤發生是一個復雜的過程，其中包含許多腫瘤抑制基因，癌基因及其相關信號通路的異常破壞。了解PCa腫瘤發生和發展的潛在機制，有利于早期診斷，風險評估和選擇針對PCa的治療策略。本研究將KIF14鑒定為參與腫瘤進展和PCa預后不良的潛在候選癌基因。
　　KIF14是參與細胞分裂，微管聚合物動力學，細胞內轉運和信號轉導的驅動蛋白家族的成員[3]。越來越多的證據表明KIF14在多種類型的腫瘤中過度表達，包括肝細胞癌，乳腺癌等[7-12]，暗示其作為潛在癌基因的作用。KIF14的上調可能是由基因組擴增引起的[9，12]。據報道，在肝細胞癌中，KIF14的缺失下調Skp2和Cks1的表達，導致p27Kip1的積累。Skp2和Cks1的下調也導致胞質分裂失敗，這可能抑制腫瘤生長。抑制KIF14通過HCC細胞中Akt激酶的失活抑制遷移并誘導細胞凋亡[7]。在三陰性乳腺癌中也報道了KIF14對AKT磷酸化的影響[9]。
　　本研究證明，KIF在多個PCa細胞系中表達上調，進一步對從Oncomine數據庫，癌癥微陣列數據庫和綜合數據挖掘平臺[16]中提取數據，基于來自PCa患者樣本的兩個數據集的分析[17，18]后可以確定，與正常前列腺組織相比，KIF14在PCa中高度過表達。在PCa細胞22Rv1中敲減KIF14后，細胞增殖和遷移能力均受到明顯抑制。這些結果均表明KIF14可能在前列腺癌的發生發展中發揮重要作用，但其促癌作用的機制以及對預后的影響目前尚不明確，有待進一步深入的研究。
　　綜上所述，KIF14過表達有助于前列腺腫瘤進展，是潛在的癌基因，KIF14可能是PCa治療的新靶點。
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　　收稿日期：2019-3-26;修回日期：2019-4-6
　　編輯/肖婷婷
　　基金項目：1.廣東省醫學科學技術研究基金項目（編號：A2017276）;2.深圳市科創委基礎研究自由探索項目（編號：JCYJ20170307095441539）
　　作者簡介：袁也晴（1985.9-），男，湖南新化人，博士，主治醫師，主要從事泌尿系腫瘤研究
　　通訊作者：張軼庠（1975.10-），男，湖南長沙人，博士，主任醫師，主要從事泌尿系腫瘤研究
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