基于網絡藥理學的羌活—獨活藥對抗炎作用機制研究

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　　摘 要 目的：預測羌活-獨活藥對抗炎活性成分及其作用機制。方法：根據口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18的原則分別篩選羌活、獨活的活性成分，通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）對羌活、獨活的潛在作用靶點進行預測和篩選，然后以“Anti-inflammatory”為關鍵詞在人類基因數據庫Genecards中檢索炎癥相關靶基因，并與羌活、獨活中活性成分靶基因映射篩選出共同靶點，再利用Cytoscape 3.5.1軟件建立活性成分-靶點網絡。將篩選得到的靶點在相互作用基因/蛋白質搜索工具平臺STRING V 10.5構建其靶蛋白相互作用（PPI）網絡，并進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路和基因本體（GO）富集分析，以研究其抗炎機制。結果：從羌活、獨活藥對中共篩選得到香豆素、β-谷甾醇、歐前胡素、紫花前胡苷等15個活性成分，作用于轉錄因子AP-1、磷脂酰肌醇激酶3r亞基、雌激素受體等49個靶點，主要涉及乙型肝炎、細胞凋亡等19條信號通路，參與炎癥反應調節、前列腺素類生物合成等47個生物過程。結論：預測了羌活-獨活藥對活性成分多靶點、多通路、多生物過程的抗炎機制，為其進一步的抗炎機制研究指明了方向。
　　關鍵詞 羌活；獨活；藥對；抗炎機制；靶蛋白相互作用；信號通路
　　Study on Anti-inflammatory Mechanism of Couplet Medicine of Notopterygium incisum-Angelica pubescens Based on Network Pharmacology
　　DUAN Kaixuan1，LI Yuewen1，LIU Hebo2，WANG Bolong1（1.School of Chemical and Biological Engineering， Yichun University， Jiangxi Yichun 336000， China；2.School of Medicine， Yichun University， Jiangxi Yichun 336000， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To predict the anti-inflammatory active components and mechanism of couplet medicine of Notopterygium incisum-Angelica pubescens. METHODS： According to the principle of oral bioavailability≥30% and drug- likeness≥0.18， active components of N. incisum and A. pubescens were screened； TCMSP was used to predict and screen the potential target of them. Using “Anti-inflammatory” as keyword， inflammatory related target genes were retrieved from human gene database Genecards. Common target was screened by mapping the target genes of active ingredients from couplet medicine of N. incisum-A. pubescens. The active ingredient-target network was established by using Cytoscape 3.5.1 software. The screened targets were used to construct the target protein interaction （PPI） network on the STRING V 10.5 platform. Its anti-inflammatory mechanism was studied by KEGG signaling pathway and GO biological enrichment analysis. RESULTS： Totally 15 active components such as coumarin， beta-sitosterol， ammidin， nodakenin were selected from couplet medicine of N. incisum-A. pubescens. Acting on 49 targets such as transcription factor AP-1， PI3-kinase subunit gamma， estrogen receptor， they mainly involved 19 signaling pathways such as hepatitis B and cell apoptosis， and were involved in 47 biological processes such as regulating inflammatory response and prostaglandin biosynthesis. CONCLUSIONS： The anti-inflammatory mechanism of active components of couplet medicine of N. incisum-A. pubescens on multi-target， multi-channel and multi-biological processes is predicted， and it points out the direction for further anti-inflammatory mechanism study. 　　KEYWORDS Notopterygium incisum； Angelica pubescens； Couplet medicine； Anti-inflammatory mechanism； Target protein interaction； Signaling pathway
　　羌活與獨活配伍始于唐《外臺秘要》之宣痹湯[1]，二藥合用屬于七情中的相須相助[2]，可散風除濕、通絡止痛，用于治療風寒濕痹。已故名老中醫焦樹德善用羌活-獨活藥對治療類風濕性關節炎，認為羌活散寒祛風、勝濕止痛行氣分，主治上肢痹癥；獨活祛風除濕、解表止痛行血分，善攻下肢痹癥。二藥相須為用，氣血雙調，上下同治，相互為用，可增強治療痹證之療效[3]。名醫孫曼之用羌活、獨活等治療感受風邪所致咳嗽、鼻塞、流濁涕以及下肢水腫、腰背疼痛等證療效顯著[4]。劉晨等[5]研究發現，羌活-獨活藥對及其單味藥對弗氏完全佐劑誘導的關節炎模型大鼠有一定的改善作用，且藥對作用優于單藥。雖然臨床上羌活-獨活聯用治療類風濕性關節炎、風濕性關節炎等炎性疾病療效明確，但是其具體作用機制尚不清楚。
　　網絡藥理學由英國鄧迪（Dundee）大學的藥理學家于2007年首次提出[6]，并闡述為“下一代藥物研究范式”。近年來，隨著系統生物學、多向藥理學、生物信息學、計算機技術等學科的快速發展與融合，網絡藥理學作為藥物研究的新模式已經從理論發展到了實踐。其以“疾病-基因-靶點-藥物”多層次、多角度的相互作用網絡為理念，挖掘藥學數據庫、生物學數據庫、疾病數據庫等多種數據庫的海量信息，運用專業的可視化網絡分析軟件及算法進行大數據綜合分析，從網絡層面系統綜合地觀察藥物如何干預和影響疾病網絡，從而揭示復雜藥物協同作用于人體的機制。其整體性、系統性的特點與中醫藥整體觀、辨證論治、組方配伍的原則不謀而合，在中醫藥藥效物質基礎[7]、作用機制[8]、新藥研發[9]、新適應證[10]、配伍規律[11]等方面展現出了巨大潛力，解決了實驗研究周期長、費用高、低通量、盲目性等諸多弊端，已成為中醫藥復雜體系研究的新機遇、新利器。故本研究擬借助網絡藥理學方法，全面、系統地分析羌活-獨活藥對的成分、靶點、通路之間的網絡關系，旨在為闡明其抗炎的藥效物質及作用機制提供理論參考。
　　1 材料與方法
　　1.1 數據庫與軟件
　　中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http；//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；通用蛋白質數據庫UniProt（http：//www.uniprot. org/uploadlists/）；人類基因數據庫Genecards（http：//www.genecards.org/）；蛋白質互作平臺STRING V 10.5（https：//string-db.org/）；生物學信息注釋數據庫DAVID V 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）；網絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.5.1（http：//cytoscape.org/）。
　　1.2 活性成分的選取
　　利用TCMSP平臺，根據口服生物利用度（OB）≥ 30%和類藥性（DL）≥0.18的原則收集羌活、獨活兩味中藥的化學成分[12]，再結合文獻報道最終確定其活性成分，統一保存為.mol2格式文件。
　　1.3 靶點篩選及活性成分-靶點網絡構建
　　通過TCMSP平臺收集羌活、獨活的潛在作用靶點，利用蛋白質數據庫UniProt轉換成對應的基因名稱，在人類基因數據庫Genecards中以“Anti-inflammatory”為關鍵詞，檢索炎癥相關靶基因，并與羌活、獨活藥對中活性成分靶基因映射篩選出共同靶點，確定為藥對活性成分的抗炎靶點。最后采用Cytoscape 3.5.1軟件建立活性成分-靶點網絡（在該網絡中，節點代表化合物、靶蛋白，邊代表化合物-靶點的相互作用）。
　　1.4 靶點相互作用研究
　　為明確羌活-獨活藥對抗炎靶點之間的相互作用，將篩選得到的靶點在STRING平臺構建其靶蛋白相互作用（PPI）網絡（圖中節點代表蛋白，線代表互作關系）。設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設為中等“Medium confidence”，其他參數保持默認設置。將PPI網絡圖導入Cytoscape 3.5.1軟件進行拓撲屬性分析。借助“Network analyzer”功能，計算參與互作靶蛋白的度值（Degree）和介數（Betweenness），選取Degree和Betweenness 同時在平均數之上的靶標作為關鍵靶標，以明確藥對作用的主要靶點（PPI中度值反映了一個節點與其他節點的連接數目，介數是網絡中所有最短路徑中經過該節點的路徑的數目占最短路徑總數的比，度值和介數是量化一個節點在網絡中重要性的主要拓撲參數）[13]。
　　1.5 京都基因與基因組百科全書代謝通路富集分析
　　利用生物學信息注釋數據庫DAVID V 6.8進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路分析，物種與背景設置均為“Homo sapiens”（智人），以P<0.05為標準，研究靶點投射各通路中的個數及其在每個通路蛋白中的占比（百分率），明確其抗炎的主要信號通路。
　　1.6 基因本體生物過程富集分析
　　通過Cytoscape 3.5.1軟件中的“BiNGO”插件對關鍵靶點進行基因本體（GO）生物過程富集分析（以P<0.05為標準判斷相關），建立GO生物過程層級關系圖，分析靶點在體內可能參與的生物過程，并用“MCODE”插件對不同的生物過程進行聚類分析（MCODE是以節點賦權重、模塊預測以及可選的后期處理為步驟的，基于密度的局部搜索聚類算法，可將不同類別GO生物過程分為不同的子簇，同一子簇下的GO生物過程具有相似的功能特性，用以探究各子簇代表的主要GO生物過程及其藥理意義）。 　　2 結果
　　2.1 主要活性成分選取結果
　　根據OB≥30%和DL≥0.18的原則篩選藥效成分，雖然部分成分（如結晶乙酸柏木酯、亞油酸甲酯等）未達標，但是這些成分在藥材中含量較高，加上較多文獻[14-16]均報道其具有明顯的藥理作用，因此將這些成分也納入到后續研究中，最終篩選出了15個化學成分。羌活、獨活藥材中活性成分及參數詳見表1。
　　2.2 靶點篩選及成分-靶點網絡圖構建結果
　　通過TCMSP平臺共找得170個靶蛋白，將這些靶蛋白轉化成對應的基因。將170個靶基因與 Genecards數據庫挖掘到的8 561個抗炎相關基因映射后，得到共同靶基因49個，即為羌活-獨活藥對抗炎作用靶點。運用Cytoscape 3.5.1軟件以15個活性成分及49個靶基因建立的活性成分-靶點網絡圖中，共有64個節點、143條邊，充分體現了羌活-獨活多成分、多靶點的作用機制。羌活-獨活藥對活性成分-作用靶點網絡圖見圖1。
　　2.3 靶點PPI 網絡分析結果
　　PPI網絡中實際包含47個節點（2個靶點未參與 PPI網絡構建）和189條相互作用連線。PPI 網絡平均Degree為8.04，平均Betweenness為3.1×10-2，Degree、Betweenness均超過平均值的靶點共有11 個，即這11個靶點為羌活-獨活藥對發揮抗炎藥效作用的關鍵靶點。羌活-獨活藥對靶點PPI網絡圖見圖2，關鍵靶點的拓撲參數見表2。
　　2.4 KEGG代謝通路分析結果
　　符合P<0.05且與炎癥密切相關的信號通路包括乙型肝炎（Hepatitis B）、細胞凋亡（Apoptosis）等19條。其中乙型肝炎信號通路與炎癥的發生密切相關（P值最?。?，故以其為例觀察藥對活性成分作用靶點在該通路中的富集情況。結果發現，羌活-獨活藥對活性成分可作用于該通路中的JUN、CAPS3、CAPS8、CAPS9、PIK3CG、BAX、CDK2、TGFB1等靶點，發揮抗炎作用?？寡鬃饔冒悬cKEGG代謝通路統計結果見表3，乙型肝炎信號通路圖見圖3。
　　2.5 GO生物富集過程分析結果
　　羌活-獨活藥對靶點GO生物過程富集得到293個生物過程。按照MCODE聚類分析算法得到47個子簇，其中與抗炎密切相關的子簇包括細胞凋亡、細胞遷移與新生血管生成、炎癥反應、T細胞反應、白細胞反應、病毒調控、皮質類固醇刺激的反應、5-羥色胺分泌的負調節、前列腺素類生物合成、淋巴調控等10個子簇。GO生物過程層級關系見圖4，子族注釋及中心GO生物富集過程見表4。
　　3 討論
　　羌活-獨活是治療類風濕性和風濕性關節炎的主要藥對，但其具體藥效成分并不清楚。本研究根據OB、DL以及文獻挖掘納入了15種成分，其中實驗研究已明確證實的抗炎成分有香豆素、β-谷甾醇、歐前胡素和紫花前胡苷。如獨活香豆素有可能通過降低大鼠血清白細胞介素1α（IL-1α）、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子的表達，對帕金森病起到保護作用[16]；β-谷甾醇與阿司匹林聯合使用比單獨使用阿司匹林的抗炎效果更強[17]。胡榮等[18]通過耳腫脹法、足腫脹法、腹腔毛細血管法證實了歐前胡素通過降低前列腺素E2（PEG2）、IL-1以及TNF-α濃度發揮抗炎作用；熊友誼等[19]發現，紫花前胡苷能顯著下調哮喘模型小鼠 IL-4、IL-5、IL-13等炎性因子水平，抑制氣道炎性反應，其余活性成分的抗炎作用還有待于實驗進一步確認。
　　PPI分析結果顯示，JUN、PIK3CG、ESR1、NOS、PTGS2等是羌活-獨活抗炎的關鍵靶點，而研究證實上述靶點與炎癥的發生發展密切相關。如JUN是哺乳動物細胞內AP-1亞單位之一；而AP-1是位于JNK下游的關鍵信號蛋白分子，JNK受刺激后，可激活JUN，使其磷酸化，從而使炎癥轉錄啟動并增強，導致炎癥持續和發展[20]。PIK3CG編碼蛋白屬于磷脂酰肌醇3-激酶 （PI3K） 的一個亞型， 主要表達在白細胞和心血管系統，在炎癥過程中扮演著重要作用[21]。研究發現[22]，人內皮細胞上ESR1激活后能減少炎癥介質TNF-α介導的促炎癥細胞黏附分子產生，從而抑制炎癥反應。NOS3又稱eNOS，是內皮型一氧化氮合酶，能夠催化血管內皮細胞合成一氧化氮（NO），而NO在免疫反應及炎癥反應中發揮重要作用，如NO可通過調節炎癥信號和調節樹突狀細胞的生命周期而表現出抗炎作用[23]。PTGS2是前列腺素合成過程中的關鍵酶，而前列腺素是一種重要的炎癥介質，參與機體炎癥反應。Ban HS等[24]發現，歐前胡素能夠抑制大鼠腹膜巨噬細胞中前列腺素的產生，同時還能抑制環氧酶2和前列腺素E合成酶產生，從而發揮抗炎作用。
　　KEGG代謝通路及GO生物過程富集結果顯示，羌活-獨活藥對靶點參與多條抗炎鎮痛通路，如乙型肝炎、細胞凋亡等，涉及病毒調控、白細胞反應、淋巴調控等炎癥生物過程。有研究也發現，歐前胡素能夠調控水泡性口腔炎病毒假型或糖蛋白gpl60包膜的人類免疫缺陷病毒Ⅰ型對T細胞和HeLa細胞的感染[25]。另有研究表明[26]，羌活能顯著抑制弗氏完全佐劑所致的大鼠足腫脹，這與其調控大鼠全血白細胞吞噬功能以及淋巴細胞轉化有關。
　　綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，對羌活-獨活藥對的活性成分、靶點以及通路間的復雜關系進行了分析，初步揭示了其通過影響細胞遷移與凋亡、調節免疫反應，抑制炎癥因子產生，從而發揮抗炎效應，這為對其做進一步的抗炎機制實驗研究指明了方向。
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　?。ㄊ崭迦掌冢?018-12-31 修回日期：2019-03-27）
　　（編輯：林 靜）
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