采用網絡藥理學研究桃仁—紅花藥對治療股骨頭壞死的分子機制

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　　摘 要 目的：研究桃仁-紅花藥對治療股骨頭壞死（ONFH）的作用機制。方法：采用網絡藥理學方法。以化合物口服利用度（OB）>30%和類藥性（DL）>0.18為標準，通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）、反向分子對接服務器（DRAR-CPI）、人類基因數據庫（GeneCards）和在線《人類孟德爾遺傳》數據庫（OMIM）篩選桃仁-紅花藥對的活性成分及治療ONFH的作用靶標。借助網絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.6.0構建活性成分- ONFH靶標網絡。結合STRING數據庫構建靶蛋白相互作用網絡，篩選連接度排名前5的靶蛋白，并利用分子對接服務器預測其與桃仁-紅花藥對活性成分的結合活性。利用生物學信息注釋數據庫（DAVID）對靶點基因本體（GO）生物過程和京都基因與基因組百科全書（KEGG）中代謝通路進行富集分析。結果：從桃仁-紅花藥對中篩選出活性成分44個，包括黃芩苷、槲皮素等，與ONFH相關的作用靶點78個，包括血管內皮生長因子（VEGF）、內皮細胞生長抑制因子（VEGI）、急性C反應蛋白（CRP）等。經分子對接服務器分析發現，桃仁-紅花藥對的活性成分與靶蛋白結合能力較強。經GO和KEGG通路富集分析發現，桃仁-紅花藥對治療ONFH的生物過程與凋亡過程負向調節、核轉錄因子κB活動的正向調節等有關，主要通過調節分泌型糖蛋白信號通路、黑色素生成信號通路、VEGF信號通路、基底部細胞癌信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶信號通路等發揮作用。結論：本研究初步明確了桃仁-紅花藥對治療ONFH的主要靶標和通路，可為后續進一步研究其藥理作用奠定基礎。
　　關鍵詞 桃仁-紅花藥對；股骨頭壞死；作用機制；網絡藥理學；中藥系統藥理學分析平臺；通路
　　Study on the Mechanism of Prunus persica-Carthamus tinctorius Couplet Medicine in the Treatment of Osteonecrosis of the Femeral Head Based on Network Pharmacology
　　DONG Hang1，XIE Yizi2，HUANG Jiahua2，JI Shuliang2，SUN Weipeng2，SUN Zhizhong2，ZENG Xiashi2，SHEN Danting2，LIN Ziling1（1.Dept. of Orthopaedics， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China；2.First Clinical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of Prunus persica-Carthamus tinctorius couplet medicine in the treatment of osteonecrosis of the femoral head （ONFH）. METHODS： The network pharmacology was adopted. The active components of P. persica -C. tinctorius couplet medicine and ONFH target were screened through TCM systematic pharmacological analysis platform target （TCMSP）， DRAR-CPI， hnuman gene database （GeneCards） and online medelian inheritance in man （OMIM） using oral availability of compounds （OB）>30% and drug like （DL）>0.18 as standard. Network topology attribute analysis software Cytoscape 3.6.0 was utilized to construct the active components-ONFH targets network. Target protein interaction network was established on the basis of STRING database， and top 5 target proteins in the list of connectivity were screened， and molecular docking server was used to predict the combination activity of active components from P. persica -C. tinctorius couplet medicine. The biological processes of target gene ontology （GO） and metabolic pathways in Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） were enriched and analyzed by DAVID. RESULTS： A total of 44 active components were screened from P. persica -C. tinctorius couplet medicine， including baicalin， quercetin， etc.， and 78 targets related to ONFH including VEGF， VEGI， CRP， etc. Through analysis of molecular docking server， binding activity of active components of P. persica -C. tinctorius couplet medicine to target protein was strong. GO and KEGG pathway enrichment analysis showed that biological process of P. persica -C. tinctorius couplet medicine for ONFH was related with negative regulation of apoptosis process and positive regulation of nuclear factor-κB transcription factor， mainly through regulating secretory glycoprotein signaling pathway， melanogenesis signaling pathway， VEGF signaling pathway， signaling pathway of basal cell carcinoma， adenosine-activated protein kinase signaling pathway. CONCLUSIONS： This study preliminarily validates the major targets and pathways of P. persica -C. tinctorius couplet medicine for ONFH， which lay a foundation for further study on their pharmacological action. 　　KEYWORDS Prunus persica-Carthamus tinctorius couplet medicine； Osteonecrosis of the femoral head； Mechanism； Network pharmacology； TCM systematic pharmacological analysis platform； Pathway
　　股骨頭壞死（Osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是指由于各種原因引起的股骨頭缺血，導致股骨頭的結構發生改變或者股骨頭塌陷，臨床癥狀以髖部疼痛、跛行、髖關節屈曲、外旋功能障礙為主，是常見的骨科疾病之一[1]。流行病學資料統計表明，我國每年約有15萬到20萬新發ONFH患者，多見于30～50歲的青壯年[2-3]。目前，臨床上還沒有特異有效的藥物治療ONFH，大多數患者后期需行手術治療，但病情易反復且治療費用高[4]，降低了患者的生活質量，也給患者帶來了巨大的經濟負擔。
　　桃仁-紅花藥對是《醫宗金鑒》中桃紅四物湯、《醫林改錯》中補陽還五湯的重要藥材組合。在《神農本草經》中提到桃仁具有散瘀血的功效；紅花具有活血通經、散瘀止痛的功效，兩者合用可起到活血化瘀的功效?，F代藥理研究結果表明，桃仁具有改善血流動力學、抗炎、鎮痛、提高免疫力等作用，紅花具有抗氧化、抗細胞凋亡等作用[5-6]。相關研究也發現，含有桃仁-紅花藥對的方劑能夠通過促進壞死組織修復、改善異常血液流變狀態、抑制破骨、降低成脂因子表達等機制改善ONFH[7-8]。
　　雖然相關研究探討了桃仁-紅花藥對改善ONFH的單一作用機制，但難以全面地反映其藥理作用機制。網絡藥理學是基于生物信息學、系統生物學、藥理學等多個學科的技術和知識，可構建藥物的“成分-靶標-通路-疾病”網絡，深入探索藥物與疾病的關系，從而多層次地闡明藥物的作用機制[9]。因此，筆者應用網絡藥理學的方法，揭示桃仁-紅花藥對治療ONFH的作用機制，為其后續研究提供參考。
　　1 資料與方法
　　1.1 數據庫與軟件
　　中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http：// ibts. hkbu. edu. hk/ LSP/ tcmsp.php）；反向分子對接服務器（DRAR- CPI，https：//cpi.bio-x.cn/drar/）；人類基因數據庫（GeneCards，http：//www.genecards.org/）；蛋白質數據庫（UniProt，http：// www.uniprot. org/uploadlists/）；有機小分子生物活性數據庫（Pubchem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；蛋白互作平臺STRING數據庫（https：//string- db.org/）；分子對接服務器（http：//www.x-mol.com）；在線《人類孟德爾遺傳》數據庫（OMIM，http：//omim.org/）；網絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.6.0；生物學信息注釋數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）；在線云平臺OmicShare網站（www.omicshare.com/tools）。
　　1.2 化學成分的收集與篩選
　　在TCMSP中分別以“桃仁”“紅花”作為關鍵詞進行檢索，獲取兩種藥物所含化學成分的相關信息，選取同時滿足口服利用度（OB）>30%、類藥性（DL）>0.18兩個條件的成分作為活性成分[10]。然后通過Pubchem檢索出每一個活性成分的3D結構，以.mol2格式保存。
　　1.3 活性成分作用靶標及ONFH作用靶標相應基因的獲取
　　將檢索得到的桃仁-紅花藥對活性成分的.mol2格式文件均上傳至DRAR-CPI，并對活性成分與蛋白的作用強度進行打分。選取Z’-score<-0.5（表示活性成分與靶標有潛在結合的可能性）作為桃仁-紅花藥對活性成分的預測靶標，利用UniProt數據庫檢索得出桃仁-紅花藥對的藥物靶標編號（PDB ID），再限定物種為“Human（人類）”，得到藥物靶標對應的基因靶標。以“Osteonecrosis of the femoral head”或“ONFH”為關鍵詞在GeneCards和OMIM中檢索收集與ONFH相關的靶標基因，并與桃仁-紅花藥對的活性成分作用靶標基因進行比對，篩選出共同靶標基因。
　　1.4 活性成分-ONFH靶標網絡的構建
　　將桃仁-紅花藥對的活性成分與ONFH作用靶標導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建其活性成分-ONFH靶標網絡。網絡中節點代表活性成分或作用靶標，邊代表活性成分與靶標的相關性。
　　1.5 靶蛋白相互作用網絡的構建
　　利用STRING數據庫檢索桃仁-紅花藥對與ONFH的潛在靶標，將物種設為“Human”（人類），設定最低相互作用閥值為中等置信度“Medium confidence” 0.4，其余參數保持默認設置，獲取桃仁-紅花藥對治療ONFH潛在靶標的相互作用關系，并導入Cytoscape 3.6.0軟件繪制其蛋白相互作用（PPI）網絡，然后使用Cytoscape 3.6.0軟件中的Network Analyzer進行網絡分析，并以連接度（Degree，表示在PPI網絡里節點通過的邊的數量；其值越大表明該節點與其他節點相互作用越重要）作為指標，調節節點的大小，繪制PPI網絡圖。
　　1.6 分子對接分析活性成分與靶蛋白的結合作用
　　基于上述PPI網絡，篩選Degree值排名前5位的靶標，導入分子對接服務器與桃仁-紅花藥對的活性成分進行分子對接，并對分子對接結果的對接分數（Docking score）進行分析，預測、評價桃仁-紅花藥對活性成分與核心靶標之間的結合活性。當Docking score值>4.25時，表示分子與靶標具有一定的結合能力；>5.0時，表示結合能力較高；>7.0時，表示結合能力很高。 　　1.7 基因本體生物過程與京都基因與基因組百科全書通路富集分析
　　將桃仁-紅花藥對的作用靶標導入DAVID中，進行基因本體（GO）分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，得到通路富集結果，選取P<0.001生物過程和通路，并且按照富集基因數從大到小排序，選取排名前20的通路，使用OmicShare網站繪制通路信息圖。檢索相關文獻，篩選可能與治療ONFH相關的通路及潛在靶標，然后與桃仁-紅花藥對的活性成分構建出“活性成分-ONFH靶標- KEGG通路”的多維網絡關系圖。
　　2 結果
　　2.1 桃仁-紅花藥對活性成分分析
　　根據OB>30%，DL>0.18，篩選出桃仁-紅花藥對的活性成分44個（兩者均含有β-谷固醇）。其中桃仁23個，包括楊樹酚苷、常春藤皂苷元、菜油甾醇等；紅花22個，包括木酚素、β-類胡蘿卜素、黃芩苷、槲皮素等。桃仁-紅花藥對部分活性成分基本信息見表1（由于本文活性成分的名稱過長，故以字母和數字的組合代替）。
　　2.2 桃仁-紅花藥對的靶標預測
　　通過DRAR-CPI查找桃仁-紅花藥對44個活性成分的靶標，得到Z’-score<-0.5的靶標2 322個。在UniProt中輸入蛋白靶標的PDB ID，獲得276個基因靶標。將所得基因靶標與OMIM與GeneCards中ONFH相關基因作比對，篩選出可能與ONFH有關的作用靶標78個。如核受體輔激活蛋白2（NCOA2）對應PBD ID為1IVT， β2型腎上腺素受體（ADRB2）對應PBD ID為3GEF等。
　　2.3 活性成分-ONFH靶標網絡構建
　　在Cytoscape 3.6.0軟件中導入桃仁-紅花藥對的活性成分與ONFH作用靶標，構建活性成分-靶標網絡，見圖1[圖中六邊形節點代表活性成分，如槲皮素（D37）等；圓形節點代表作用靶標，如血管內皮細胞生長抑制因子（VEGI）等]。
　　由圖1可得，此網絡共包括節點123個，邊389個。不同的節點代表桃仁-紅花藥對的潛在活性成分與作用靶標。圖中桃仁-紅花藥對中一個靶標可對應相同的活性成分，也可與不同的活性成分相對應，提示桃仁-紅花藥對治療ONFH具有多成分、多靶標的特點。
　　2.4 靶蛋白相互作用網絡分析
　　將桃仁-紅花藥對可能與ONFH相關的78個靶標導入STRING數據庫獲取的相互作用關系，使用Cytoscape 3.6.0軟件繪制PPI網絡圖，結果詳見圖2。
　　由圖2可得，此網絡共包括節點78個，邊582個。圖中Degree值越大則節點越大。結果提示，桃仁-紅花藥對抗ONFH的靶標中Degree值最高的5個靶點為血管內皮生長因子（VEGF）、VEGI、急性C反應蛋白（CRP）、B細胞淋巴瘤2（BCL2）、成骨細胞特異性轉錄因子（RUNX2）。
　　2.5 分子對接結果
　　蛋白的Degree值代表與其有相互作用關系的蛋白數量。Degree值越大意味著該蛋白在桃仁-紅花藥對治療ONFH中具有重要作用。本研究選取靶標相互作用網絡中Degree排名前5的關鍵靶標做分子對接驗證。在分子對接服務器中輸入5個蛋白靶標的PDB ID，并與桃仁-紅花藥對44個活性成分進行對接，結果詳見圖3。
　　由圖3可得，有26個Docking score值>7.0，其中白細胞介素6（IL-6）2個、腫瘤壞死因子（TNF）5個、VEGF 3個、內皮素1（EDN1）2個、轉化生長因子β1（TGFB1）6個，由此可知，桃仁-紅花藥對的活性成分與靶標的結合能力較強。
　　2.6 GO和KEGG通路富集分析
　　對桃仁-紅花藥對活性成分的對應靶標進行GO 和 KEGG 分析，以P<0.001為閾值篩選前20的GO生物過程與KEGG代謝通路，桃仁-紅花藥對治療ONFH的GO生物過程見圖4，桃仁-紅花藥對治療ONFH的KEGG代謝通路見圖5。
　　由圖4、圖5可知，桃仁-紅花藥對治療ONFH的GO生物過程與凋亡過程負向調節、核轉錄因子κB活動的正向調節、以DNA為模板的轉錄正向調節、絲氨酸肽基磷酸化正向調節等相關；桃仁-紅花藥對治療ONFH的KEGG代謝通路與分泌型糖蛋白（Wnt）信號通路、黑色素生成通路、VEGF信號通路、基底部細胞癌信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路等關系較為密切。
　　2.7 活性成分-ONFH靶標-KEGG通路網絡構建
　　通過閱讀文獻在排名前20的KEGG通路中選出可能與ONFH相關的通路，并將其與桃仁-紅花藥對的活性成分、作用靶標一一對應，構建活性成分-ONFH靶標-KEGG通路多維網絡圖，詳見圖6。
　　由圖6可知，桃仁-紅花藥對治療ONFH涉及的活性成分共19個，如黃芩素、槲皮素、β-類胡蘿卜素等，其作用的靶標主要有VEGF、VEGI、CRP、BCL2、RUNX2等39個；靶標主要涉及分泌型糖蛋白信號通路、VEGF信號通路等，表明桃仁-紅花藥對治療ONFH涉及多成分、靶標及通路。
　　3 討論
　　本研究共收集到桃仁-紅花藥對治療ONFH的活性成分44個，可能與ONFH相關的作用靶標78個，提示桃仁-紅花藥對治療股骨頭壞死具有多成分、多靶標的特點，其PPI網絡圖也呈現出桃仁-紅花藥對與ONFH各蛋白靶標之間關系密切，提示其作用機制復雜多樣，非單一蛋白靶標作用而成。分子對接分析結果顯示，桃仁-紅花藥對的活性成分與各蛋白靶標之間結合能力較強，在此基礎上進行網絡分析結果可信度較高，參考價值較大。
　　活性成分-ONFH靶標-KEGG通路網絡結果顯示，桃仁-紅花藥對治療股骨頭壞死涉及Wnt信號通路、VEGF信號通路、AMPK信號通路、核轉錄因子κβ受體活化因子-核轉錄因子κB受體活化因子配體-骨保護素（RANK-RANKL-OPG）信號通路等。Wnt信號通路是胚胎發育與細胞凋亡調控的一條重要通路[11]，在骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞以及成骨細胞的增殖分化過程中起調節作用[12]。相關研究發現，黃芩苷可通過調控Wnt信號通路以促進骨髓間充質干細胞的分化與成熟[13]。此外，有研究發現，黃芩苷在一定干預時間與藥物濃度內，可隨其干預時間的延長和藥物濃度的增加而使OPG mRNA的表達增強、RANKL mRNA的表達減弱，進而調節RANK-RANKL-OPG信號通路[14-16]。VEGF是血管形成的主要刺激因子，與ONFH的發生相關，能抑制骨細胞程序性死亡，促進骨細胞生成，修復壞死的骨組織，改善預后[17-19]。AMPK信號通路中的AMPK同樣在骨組織的生理活動中發揮重要作用[20]。相關研究發現，槲皮素可作用于人體內的VEGF、AMPK信號通路，通過相關通路影響ONFH的發生發展[21-23]。綜上，筆者推測桃仁-紅花藥對主要通過影響骨髓間充質干細胞分化以及調節成骨細胞與破骨細胞的生理活動以達到治療ONFH的目的。 　　本研究結果表明，桃仁-紅花藥對治療ONFH的過程涉及了多個活性成分、作用靶標及生物過程，但本研究只是在分子機制上進行的預測探討，具體藥物作用機制仍需進一步實驗進行驗證。
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　?。ㄊ崭迦掌冢?018-09-05 修回日期：2019-01-02）
　　（編輯：唐曉蓮）
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