4個香菇品種的AFLP分子標記研究

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　　摘要    試驗以香菇LB-21、香菇L808、香菇215和香菇B15-1等4個品種為研究材料，采用AFLP分子標記技術分析其遺傳多樣性。結果表明，4個香菇品種之間的遺傳相似性系數變化范圍為0.669 5～0.878 7;UPGMA法聚類分析發現，4個品種分為2組，香菇LB-21與香菇B15-1親緣關系較近，遺傳相似性系數為0.874 5，香菇L808與香菇215親緣關系較近，遺傳相似性系數為0.878 7。
　　關鍵詞    香菇;AFLP分子標記;遺傳多樣性;聚類分析
　　中圖分類號    S646.12        文獻標識碼    A        文章編號   1007-5739（2019）09-0047-02
　　Abstract    The genetic diversity of LB-21，L808，215 and B15-1 Lentinus edodes varieties was analyzed by AFLP molecular marker.The results showed that the variation range of genetic similarity coefficient among the four Lentinus edodes varieties was 0.669 5-0.878 7.UPGMA clustering analysis showed that the four varieties were divided into two groups，LB-21 and B15-1 were closely related，and the genetic similarity coefficient was 0.874 5. L808 and 215 were closely related，and the genetic similarity coefficient was 0.878 7.
　　Key words    Lentinus edode;AFLP molecular marker;genetic diversity;clustering analysis
　　香菇（Lentinus edodes（Berk.）sing）又名香蕈、冬菇、花菇、椎茸等，在分類學上隸屬于擔子亞門層菌綱傘菌目側耳科香菇屬[1]。其味道鮮美，營養豐富，藥用價值較高，是世界第二大食用菌，也是世界真菌學家研究的熱點。我國香菇栽培歷史悠久，栽培面積逐年增加，菌種選育和栽培技術研究等工作受到了科研工作者的重視。香菇菌種是香菇產業化發展的重要基礎，決定了其產量和質量。從分子生物學水平鑒定菌種和構建DNA指紋圖譜有助于準確識別菌種，從而有效地利用不同香菇品種的優勢，促進香菇生產的發展[2]。
　　目前，應用于香菇種質資源研究的分子標記主要有SSR、AFLP、RAPD、SCAR、SRAP[3-7]。AFLP分子標記技術具有模板量少、引物通用性高、多態檢出率高、穩定性和重復性較強等優點，廣泛應用于植物分子遺傳圖譜構建、遺傳多樣性及親緣關系研究、基因定位和分子標記輔助育種等研究領域[8-9]。本試驗利用AFLP分子標記技術分析不同香菇品種的遺傳多樣性，從基因水平反應品種之間的關系，為進一步開展香菇生物學研究提供一定的試驗依據。
　　1    材料與方法
　　1.1    試驗材料
　　供試香菇品種共4個，即香菇LB-21、香菇L808、香菇215和香菇B15-1，均來自陜西省微生物研究所微生物菌種資源中心第三研究室。香菇LB-21是選育品種，抗霉菌能力強、產量高，經小面積栽培產量穩定;香菇L808是廣溫型品種，菇體中等偏大、菇形圓整、菇柄較短、菇質優、菌齡短，產量高;香菇215是中高溫型品種，菌肉厚實，菌柄中長偏短，抗逆性強，產量高;香菇B15-1是野生香菇菌株，抗雜菌污染能力強，柄短肉厚。
　　1.2    主要試劑及引物
　　主要試劑有Taq酶（2 U/μL）、dNTP（10 mmol/L）、引物（10 mmol/L）（生工基因）、內切酶（10 U/μL）（NEB公司）、T4連接酶（5 U/μL）（NEB公司）。Marker為DL2000、100 bp DNA Ladder。引物在北京六合華大基因科技有限公司合成。試驗所用接頭和引物信息見表1，試驗所用引物組合見表2。
　　1.3    試驗方法
　　1.3.1    樣品DNA提取。采用改良CTAB法進行DNA提取，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
　　1.3.2    限制性內切及連接。對所選樣品采用EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切，酶切與連接反應同步進行。酶切與連接體系（20 μL）為：10×AFLP digest-ligation Buffer 2 μL，AFLP digest-ligation Enzyme Mix 1.8 μL，EcoR I Adaptor 1 μL（10 μmol/L），Mse I Adaptor 1 μL（10 μmol/L），模板DNA 5 μL，用ddH2O補至20 μL。酶切-連接反應條件為25 ℃、5 h，1%瓊脂糖電泳檢測。
　　1.3.3    預擴增。預擴增反應體系：2×PCR Mix 10 μL，E00 1 μL（20 μmol/L），M00 1 μL（20 μmol/L），酶切-連接模板DNA 4 μL，加ddH2O至20 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s;50 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環;將預擴增產物4 ℃保存備用。 　　1.3.4    選擇性擴增。將預擴增產物稀釋后作為模板進行PCR擴增。反應體系：2×PCR Mix 10 μL，Eprimer 1 μL（20 μmol/L），Mprimer 1 μL（20 μmol/L），模板DNA 5 μL（預擴產物稀釋20倍），加ddH2O至20 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性35 s，65 ℃復性35 s（每循環降低0.7 ℃），72 ℃延伸1 min，12個循環;94 ℃變性30 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，23個循環。
　　1.3.5    聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析。選擇擴增PCR產物和上樣緩沖液比例8∶3，旋渦混勻，94 ℃變性10 min后，于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，銀染后觀察。利用Quantity One軟件對4個樣品、12對引物組合擴增產物測序儀得到的原始數據進行分析，根據無帶和有帶情況轉化為0和1數據矩陣。采用NTSYSpc 2.11軟件包進行個體相似系數計算，并采用UPGMA法進行聚類分析，利用popgene和NTSYS軟件對樣品進行遺傳多樣性分析。
　　2    結果與分析
　　2.1    聚丙烯酰胺凝膠分析
　　利用12對隨機引物組合對4個香菇品種的基因組DNA進行擴增，AFLP擴增產物長度介于100～500 bp之間，條帶清晰。擴增電泳圖譜見圖1。
　　擴增條帶總數為239條，其中多態性條帶為100條;引物組合P5擴增出的多態性條帶最多，多態百分比為65.38%;引物組合P9擴增出的多態性條帶最少，多態百分比為15.38%。
　　2.2    品種多態性分析
　　由表3可知，香菇LB-21擴增出的條帶總數為180條，其中多態性條帶41條，多態比率最低，為22.78%，特有條帶2條;香菇L808、香菇215分別擴增出195、188條，多態性條帶分別為52、49條，其中特有條帶分別為12、2條;香菇B15-1擴增出的條帶總數為196條，多態性條帶57條，多態比率最高，為29.08%，含特有條帶7條。
　　2.3    遺傳相似性系數分析
　　由表4可知，4個香菇品種之間的遺傳相似性系數變化范圍為0.669 5～0.878 7。香菇LB-21與香菇L808、香菇215之間的遺傳性系數較小，說明遺傳距離較遠;與香菇B15-1之間的遺傳相似性系數較高，為0.874 5。香菇L808與香菇215之間的遺傳相似性系數較高，為0.878 7;與香菇B15-1之間的遺傳性系數較小，說明遺傳距離較遠。
　　2.4    聚類分析
　　采用UPGMA法進行聚類分析，得到4個香菇品種的親緣關系樹狀圖。從圖2可以看出，4個香菇品種被分為了2組，其中香菇LB-21與香菇B15-1為一組，說明這2個品種親緣關系相對較近，遺傳相似性系數為0.874 5;香菇L808與香菇215為一組，兩者親緣關系較近，遺傳相似性系數為0.878 7。
　　3    結論
　　試驗結果表明，采用12對隨機引物組合擴增4個香菇品種基因組DNA，香菇B15-1擴增條帶總數為196條，多態性條帶57條，多態比率最高（29.08%），含有特有條帶7條
　　香菇L808、香菇215擴增條帶總數分別為195、188條，多態性條帶分別為52、49條，其中特有條帶分別為12、2條;香菇LB-21擴增條帶總數為180條，其中多態性條帶41條，多態比率最低（22.78%），特有條帶2條。
　　4個香菇品種之間的遺傳相似性系數變化范圍為0.669 5～0.878 7。采用UPGMA法進行聚類分析，結果發現，4個品種被分成了2組，其中香菇LB-21與香菇B15-1為一組，說明這2個品種親緣關系相對較近，遺傳相似性系數為0.874 5;香菇L808與香菇215為一組，兩者親緣關系較近，遺傳相似性系數為0.878 7。
　　4    參考文獻
　　[1] 卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州：河南科學技術出版社，2000.
　　[2] 卓英，譚琦，陳明杰，等.香菇主要栽培菌株遺傳多樣性的AFLP分析[J].菌物學報，2006，25（2）：203-210.
　　[3] 董慧，章爐軍，張美彥，等.中國香菇主栽品種遺傳多樣性的SSR分析及指紋圖譜構建[J].微生物學通報，2017，44（6）：1427-1436.
　　[4] 程水明，干建平，劉世旺，等.AFLP分子標記在香菇F1代群體中的多態性及分離方式[J].湖北農業科學，2009，48（12）：2922-2926.
　　[5] 葉長文，譚海芹，吳應淼，等.香菇135和9015品種遺傳多樣性的RAPD分子標記研究[J].浙江大學學報（理學版），2013，40（2）：230-233.
　　[6] 趙微微，李海波，付立忠，等.47個香菇主栽菌株的SCAR標記分子鑒別[J].食用菌學報，2010，17（2）：7-14.
　　[7] 劉靖宇，宋秀高，葉夏，等.香菇菌株遺傳多樣性ISSR、RAPD和SRAP綜合分析[J].食用菌學報，2011，18（3）：1-8.
　　[8] 陳立佼，柴紅梅，黃興奇，等.尖頂羊肚菌遺傳多樣性的AFLP分析[J].食用菌學報，2013，20（2）：12-19.
　　[9] 王曉英，郭廷松，王新花，等.4個蘋果品種的AFLP分子標記研究[J].山東農業大學學報（自然科學版），2018，49（1）：90-93.
　　基金項目   陜西省科技廳農業領域重點研發計劃項目（2017NY-010）。
　　作者簡介   雷萍（1966-），女，陜西西安人，副研究員，從事食藥用真菌的研究與開發工作。
　　通信作者
　　收稿日期   2019-01-22
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