植物內生真菌的分類鑒定方法

來源:用戶上傳      作者:

　　摘  要：該文介紹了植物內生真菌分類鑒定的方法，主要包括形態學鑒定和分子生物學鑒定2種方法。
　　關鍵詞：植物;內生真菌;鑒定
　　中圖分類號  S663.9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2019）10-0036-02
　　真菌廣泛存在于自然界中，且種屬繁多，有些菌種形態上并無明顯差異，僅靠形態特征或生理、生化指標，很難把握真菌之間的親緣關系[1]。雖然現代分子生物學技術在真菌分類研究中應用廣泛，真菌分類和系統發育研究也取得了很大的進展[2]，但形態學鑒定仍是鑒定真菌的重要參考依據。對真菌進行分類鑒定時，多采用形態學、分子生物學相結合的方法。
　　1 形態學鑒定
　　傳統的真菌分類主要參照魏景超《真菌鑒定手冊》[3]，依據真菌形態、理化特性及超微特征等表型特征，進行初步分類工作。目前形態學的鑒定主要使用光學顯微鏡和掃描電鏡2種技術。
　　1.1 光學顯微鏡 根據內生真菌在PDA培養基上的培養特征（生長速度、大小、菌落紋飾、質地、邊緣）進行分類及去重復，采用透明膠帶法粘貼好菌絲，鏡檢觀察真菌分生孢子梗、分生孢子形態及大小等顯微特征，參考文獻[4]進行內生真菌的初步分類。
　　1.2 掃描電鏡 近年來，越來越多的學者將掃描電鏡技術應用于真菌的形態學鑒定中，傳統的光學顯微鏡雖然也能觀察到真菌的基本形態，但真菌的表面超微結構必須使用掃描電鏡進行觀察，在SEM下可清晰地分辨出真菌的菌絲、大分生孢子和小分生孢子[5]。采用插片法培養菌株讓其菌絲生長與玻璃片表面，取出玻璃片。首先用2.5%戊二醛在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.0）中固定樣品超過4h，然后洗滌3次。在PBS中用1%（W/V）鋨酸鋨（OsO4）后固定1h，再次洗滌3次。通過一系列乙醇（50，70，80，90，95和100%）將樣品在每個步驟脫水約15～20min，轉移到乙醇和乙酸異戊酯的混合物（v︰v=1︰1）約30min，然后轉移到純的乙酸異戊酯約1h。最終，在樣品表面涂覆上金鈀，之后用掃描電子顯微鏡觀察。
　　2 分子生物學鑒定
　　目前，在真菌分類方面的較常應用的分子生物學技術主要有核酸序列分析、聚合酶鏈反應（PCR）、限制性片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增多態性DNA分析（RAPD）、擴增片段長度多態性分析（AFLP）等。
　　2.1 核酸序列分析 核酸序列分析是目前常用的真菌分類技術之一。真核生物的rDNA單位包含18S、ITS、28S、IGS，其中5.8S兩側有2個內轉錄間隔區ITS（internal transcribed spacer）[6]。rDNA基因在真菌中廣泛存在，且多拷貝。由于ITS序列不加入成熟核糖體，選擇壓力比較小，進化速度較快，表現出極為廣泛的序列多態性，在進化中形成高度的保守性和一定的變異性，種間差異較為明顯[7]。然而，由于特定堿基位點的速率差異或類群之間進化速率的差異等原因造成的基因沖突[8]，目前常用的單基因片段進行的核酸序列分析并不能解決此問題。在此基礎上，Tayloretal[9]提出采用多基因片段構建系統發育樹從而識別物種的方法（GCPSR），可能會成為真菌鑒定中較常采用的方法。何亞濤[10]等利用ITS和LSU基因構建的系統發育樹，證明血紅紅曲M.sanguineus與紫色紅曲M.purpureus為不同種。
　　2.2 限制性片段長度多態性（RFLP）分析 限制性片段長度多態性（RFLP）分析技術的原理是不同個體進化過程中，DNA結構存在差異。當DNA序列在限制性內切酶的識別位點發生差異，或當DNA片段的插入、缺失或重排時，限制性內切酶將基因組DNA酶解，產生很多長短不一的片段，這些片段以不同的遷移率經過凝膠電泳，從而被區分出來，就可以獲得RFLP圖譜進行多態性分析[11-12]。RFLP分析具有數據信息量大、重復性好、結果穩定可靠等優點。但RFLP技術存在對樣品純度要求高，無法檢測靶序列中的重復序列之類的缺點[13]。RFLP技術常用于真菌的研究，宋風雅[14]等將PCR-RFLP分析技術應用于橡膠林土壤真菌區系變化的研究，結果顯示，隨著時間和土壤深度的變化，真菌18SrDNA的PCR-RFLP圖譜存在著一定的差異，PCR-RFLP技術能準確反映土壤微生物的動態變化。喬蓬蕾[15]以不同連作茬次黃瓜根際土壤為研究對象，利用末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）技術研究了土壤細菌、真菌菌群結構的動態變化，研究發現黃瓜連作障礙對真菌產生了一定的影響，建立了能解決連作障礙的方法。
　　2.3 隨機擴增多態性DNA（RAPD）分析 RAPD是由Welsh等[15]和Williams等[16]于1990年建立的一種建立在PCR基礎上的分子標記手段，RAPD在真菌上主要用于種群變異的研究及種間、種內的區分等，在真菌的系統學研究也有應用。RAPD分析技術所需模板量少，可以適應種及種下各水平的進化分析;因不使用同位素，較為安全;此外還具有速度快、成本低、靈敏度高等特點，但分析結果受很多相關因子的影響[17]，具有一定的使用局限性。龔斌[18]采用RAPD技術對3種紅樹林植物健康與非健康葉片中真菌進行分類鑒定，對于分離到的157株內生真菌，把它劃為19種不同的種，歸屬2個大的分支。韓利剛[19]選取瓶霉屬外瓶霉屬8個種的11個菌株，對其進行RAPD擴增，根據分析結果，可將11個菌株劃分為8個群，分別代表了8個種，根據最長距離法還可將11個菌株分成兩大類，分別代表了瓶霉屬和外瓶霉屬，這與傳統的形態分類法的結果基本一致，證明RAPD技術是研究瓶霉屬、外瓶霉屬兩屬間及屬內各菌種間的分類和相互關系的有效手段。
　　2.4 擴增片段長度多態性分析（AFLP） AFLP是基于RFLP與PCR技術的DNA指紋技術，同時具有RAPD技術和RFLP技術優點，靈敏度高，重復性好，結果穩定可靠，適用于各種大小不同的基因組，是一種理想的分子標記[19]?，F已廣泛用于分類學和系統學等領域，但在真菌上的應用還較少。 　　但AFLP技術存在擴增時容易出現假陽性、凝膠背景雜亂，難以鑒別等位基因等缺點，導致這項技術具有一定的局限性[20]。張艷菊[21]等利用16對引物對我國8個城市351個供試尖孢鐮孢菌進行AFLP分析，結果表明，AFLP標記選擇性擴增多態性高，能夠揭示大量的多態性位點，可獲得親緣關系很近的菌株間DNA水平上的多態性及親緣關系，是研究黃瓜枯萎病菌基因組多態性的一種較為高效的分子標記技術。卓英[22]采用AFLP技術分析了收集到的31個主要香菇栽培菌株的DNA多態性。采用6對引物共擴增得到了443條DNA帶，其中共有條帶為189條，多態性比率為57.34%，可為香菇的栽培菌株質量監測和菌種鑒定提供快速有效的技術手段。
　　3 結語
　　隨著現代生物技術的高速發展，出現了許多更為快速有效的鑒定方法，為真菌分類提供了更多的有效幫助。在進行真菌分類時，可以根據需要選擇較為符合實際情況的方法。
　　參考文獻
　　[1]楊祝良.基因組學時代的真菌分類學：機遇與挑戰[J].菌物學報，2013，32（6）：931-946.
　　[2]Yang Z L .Molecular techniques revolutionize knowledge of basidiomycete evolution[J].Fungal Diversity，2011，50（1）：47-58.
　　[3]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，1979.
　　[4]徐佳，陳彬，雷曉凌，等.叢生盔形珊瑚共附生可培養真菌多樣性分析[J].微生物學通報，2011，38（8）：1193-1198.
　　[5]唐芳，歐陽毅，祁智慧.基于掃描電鏡觀察研究真菌孢子檢測對稻谷霉變判定[J].中國糧油學報，2018，33（4）： 122-126.
　　[6]余知和，曾昭清.DNA分子標記技術在真菌系統學研究中的應用及影響[J].菌物學報，2013，32（1）.
　　[7]李倩，閆淑珍，陳雙林.基于rDNA ITS序列對絨泡菌目黏菌系統發育的探討[J].菌物學報，2015，34（3）.
　　[8]鄒新慧，葛頌.基因樹沖突與系統發育基因組學研究[J].植物分類學報，2008，46（6）：795-807.
　　[9]Taylor J W，Jacobson D J，Kroken S，et al.Phylogenetic Species Recognition and Species Concepts in Fungi[J].Fungal Genetics & Biology，2000，31（1）：0-32.
　　[10]何亞濤，冉琴琴，柳玉瑛，等.基于多基因分析對我國紅曲霉屬Monascus真菌的系統發育研究[J].菌物學報，2018，37（09）：48-63.
　　[11]方炳良.限制性片段長度多態性分析[J].基礎醫學與臨床，1991（6）：376-380.
　　[12]劉寧，金保偉，胡景輝，等.真菌分類中分子生物學方法的原理及其應用[J].華北農學報，2017.
　　[13]余知和，曾昭清.DNA分子標記技術在真菌系統學研究中的應用及影響[J].菌物學報，2013，32（1）.
　　[14]徐傳林，李會軍，李萍，等.川貝母藥材分子鑒定方法研究[J].中國藥科大學學報，2010（3）：226-230.
　　[15]Welsh J，Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（24）：7213-7218.
　　[16]Williams J G K，Kubelik A R，Livak K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（22）：6531-6535.
　　[17]龔斌，方懷義，劉小雪，等.三種紅樹林植物健康與非健康葉片中真菌的比較[J].廣西植物，2017（3）.
　　[18]李敏慧，向梅梅.RAPD在真菌分類鑒定上的應用[J].仲愷農業工程學院學報，2003，16（1）：61-67.
　　[19]裴德翠.AFLP：DNA指紋分析的有力手段[J].微生物學免疫學進展，2002，30（3）：66-70.
　　[20]張傳博，蘇曉慶.幾種基于基因組DNA的真菌分類技術研究進展[J].貴州師范大學學報（自然科學版），2006，24（1）.
　　[21]張艷菊，陳霞，劉東，等.黃瓜枯萎病菌遺傳多樣性的AFLP分析[J].植物病理學報，2011，41（3）：301-304.
　　[22]卓英，譚琦，陳明杰，等.香菇主要栽培菌株遺傳多樣性的AFLP分析[J].菌物學報，2006，25（2）.
　　（責編：張宏民）
轉載注明來源:http://www.hailuomaifang.com/1/view-14854852.htm