云南榧樹內生真菌的分離
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摘要：植物伴生的微生物是一個多樣性十分豐富的微生物類群，而植物的內生真菌主要分布于沒有外在感染癥狀的健康植物組織內。野生的榧樹因其具有重要的藥用價值而受到關注，本次研究以云南榧樹為研究對象，對其內生真菌進行了分離和保藏，為藥用相關活性物質的研究奠定基礎。
關鍵詞：云南榧樹;內生真菌;分離;保藏
1前言
1.1植物內生真菌的定義
植物內生真菌（Endophytic fungi）是指在健康植物寄生的，在各種組織和器官內部或細胞間隙中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現任何癥狀的一類真菌，這是內生真菌的廣義定義，包括了菌根真菌和所有植物病原菌在內的一個大類群。目前的內生真菌研究中，多數研究者傾向于一種狹義的概念—植物內生真菌是生活在地上部分活的植物組織內并不引起明顯病害癥狀的一類真菌。
1.2植物內生真菌的應用
目前，內生真菌的研究主要集中在2個方面：（1）植物中的內生真菌對植物本身的影響，（2）對植物內生真菌次生代謝產物的研究。重點是發現具有各種生物活性的新的化合物。
內生真菌分布于植物組織內，可獲得足夠的碳源、氮源，而且受到植物組織的良好保護，因而比暴露于惡劣環境的附生菌和腐生菌具有更穩定的生存環境，更易于發揮作用。
2試驗目的與方法
2.1試驗目的與意義
云南榧樹（Torreya yunnanensis）屬于紅豆杉科的榧樹屬，主要分布于云南西北部的麗江、維西、貢山、中甸等地，是珍稀瀕危物種。云南榧樹不僅經濟價值高，其醫用、藥用價值也很高。本試驗基于云南榧樹的藥用功能，分離其內生真菌，旨在能分離純化出對醫用、藥用研究有益的真菌。
2.2試驗材料和設備
2.2.1材料與試劑。云南榧樹：研究樣品采集自云南省迪慶州維西縣，選用無可見病斑的、健康的云南榧樹莖和葉;無菌水、馬鈴薯、瓊脂、蔗糖、硫酸鏈霉素、75%的酒精、0.13%的升汞、水。
2.2.2培養基。真菌的培養采用PDA瓊脂培養基，PDA的配方為：去皮馬鈴薯200g，瓊脂12～15g，蔗糖20g。
2.2.3儀器與設備。無菌材料袋、封口膜、報紙、棉線、燒杯、錐形瓶、培養皿、試管、量筒、試紙、酒精燈、打火機、鑷子、解剖刀、解剖剪、解剖針、電子天平、普通天平、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、微波爐以及冰箱等。
2.3試驗方法
2.3.1培養基的配置及準備。去皮馬鈴薯200g，加水熬出馬鈴薯汁;取15g瓊脂，將瓊脂加水后加熱使之溶解;將馬鈴薯汁和瓊脂混合后加入20g蔗糖，待蔗糖溶解后，加蒸餾水定容至1L。溶液配好后測試其pH值，要求其pH值約為5.6～5.8，若其pH值不在此范圍內，用1moL/L的HCL或1moL/L的NaOH調節。
為了確定植物內部環境對內生真菌的培養有無更好的效果，用同樣的步驟配置1份PDA培養基，但在定容時用云南榧樹莖、葉熬的汁定容。用蒸餾水定容的培養基記為“PDA（水）”，用云南榧樹汁定容的培養基記為“PDA（汁）”。
將制作好PDA培養基分裝在500mL的錐形瓶里，用封口膜和報紙將瓶口封好;用報紙包好試驗過程中所用的相關器械用品;取5瓶蒸餾水用封口膜和報紙封好;把培養基、蒸餾水和相關器械用品放入高壓滅菌鍋內進行121°C高溫高壓滅菌30min，以備使用。
2.3.2內生真菌的分離與培養。（1）操作過程。①在超凈工作臺上，將云南榧樹莖和葉用75%的酒精漂洗5min，再用0.13%的升汞浸泡15min進行材料表面消毒，接著用滅菌后的蒸餾水漂洗4次，清除材料表面的消毒液;②在滅過菌的培養皿中將葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，且葉片兩端都要用解剖刀切出切口以便內生真菌的長出;將嫩莖切成0.5cm的小段，把老莖的莖皮用解剖刀取下切成0.5cm×0.5cm的小塊，分別置于PDA（水）和PDA（汁）培養基上，每皿3～5塊，再用封口膜把培養皿封好;再取l皿PDA（水）和l皿PDA（汁）培養基，對所消毒材料沖洗后的第4次無菌水進行涂板培養，以作空白對照;③避光培養3～7d，每天觀察。
2.3.3內生真菌的純化。取切口處新長出的菌絲，及時轉接至新鮮PDA培養基上，每種菌絲轉接2皿。新鮮PDA原料為PDA（水），但在PDA（水）里加入硫酸鏈霉索抑制細菌的生長，便于得到純真菌。待新的培養基上長出菌絲后，再轉接至新鮮PDA培養基上，反復多次得到形態完全一致的單菌落即純化的內生真菌。
2.3.4內生真菌的保存。①試管斜面保存。把純化的真菌轉接至試管內，每株轉接3支，用報紙包好放入冰箱內保存。培養皿用封口膜緊封住。②甘油冷凍保藏。試管斜面只能作菌株臨時保存，為了使分離的菌種能長期保存，也對10株內生真菌進行甘油冷凍保藏。
20%（V/V）甘油的制備：取20mL甘油加入80mL蒸餾水，混勻。用注射器分別取1.8 mL加入凍存管中，放入凍存盒，高溫高壓滅菌30min，冷卻后備用。每支甘油管中放3～4塊帶菌培養基，放入4℃冰箱冷藏24h后，轉入-20°C冷凍24h，結冰后轉入-40℃冰柜長期保存。
3結果與討論
根據試驗統計，結果表明：用云南榧樹莖、葉熬的汁定容的PDA和用蒸餾水定容的PDA對云南榧樹內生真菌的生長影響不大;在所選3種材料中，最先長出內生真菌的是莖皮，接著是嫩莖，最后是葉片。不同的內生真菌在生長后期表現出較大的差異，生長前期菌絲多為白色，后期菌絲多能夠產生色素，而且形態不一。
?。?）內生真菌系統地分布于植物體根、莖、葉、花、果實和種子等器官、組織的細胞或細胞間隙。近年來，已從宿主植物的根、莖、葉及儲藏器官內分離到大量內生真菌。該試驗從云南榧樹植株莖皮、嫩莖中分離出真菌數量較多，從葉中分離出少量內生真菌;葉中分離的內生真菌數量少是因為本身葉片真菌數量就少，還是因為葉片切口與培養基的接觸面積過小還有待探究。
?。?）在內生真菌分離過程中，檢測超凈臺內環境的無菌狀態十分必要，否則空氣中的雜菌落到材料表面，且長出菌落，就無法察覺，而且單設漂洗液檢驗法、組織印跡法或組織壓入法為對照處理都不嚴密，因此應同時設置超凈工作臺無菌狀態檢測對照、漂洗液無菌檢驗對照和組織印跡無菌檢測對照3種對照處理，以確保準確分離植物內生真菌。
?。?）菌種保藏主要是根據微生物生理生化特點，人工創造條件，使微生物代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態。好的保藏方法首先應能長期保持菌種原有的優良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經濟。斜面保藏也稱傳代培養保藏法，此法操作簡單，但保存時間短，需要經常移種，易于變異，只能作為菌種的短期保藏。而甘油冷凍保藏法簡單有效，保藏時間可達2～10年。為菌種的長期保存和后續研究提供了便利。
?。?）本次研究以云南榧樹為研究對象，對其內生真菌進行了分離和保藏，為藥用相關活性物質的研究奠定了基礎。
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