貯藏期蒜薹表面真菌群落組成分析

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　　摘要 蒜薹作為一種傳統常年供應的蔬菜深受喜愛，由于貯存時間長，貯存過程中會有多種真菌產生，導致蒜薹失去經濟價值。本文通過提取貯藏期蒜薹表面真菌的基因組DNA，經Illumina平臺對7個樣本的ITS擴增子進行測序，共獲得2 418 016條raw reads，51個OTUs。通過OTU物種注釋和物種豐度聚類，優勢真菌屬組成為：青霉菌屬Penicillium 81.08 %，未知子囊菌15.13%，耐冷酵母Mrakia 1.74%，小球殼屬Mycosphaerella 1.02 %。青霉菌是貯藏蒜薹后期表面的主要真菌。
　　關鍵詞 貯藏蒜薹; 真菌; 擴增子測序; ITS; 多樣性分析
　　中圖分類號： S 436.33
　　文獻標識碼： A
　　DOI： 10.16688/j.zwbh.2018216
　　Abstract Garlic bolt is a kind of traditional vegetable in China. Due to long storage， the rot associated with fungi makes garlic bolts lose their economic value. In this study， the genomic DNA of seven samples of garlic bolts from cold storage was extracted， and the ITS region was amplified and sequenced on Illumina Miseq platform. A total of 2 418 016 raw reads and 51 OTUs were obtained. Through the OTU species annotation and species abundance clustering， the dominant fungal groups were Penicillium （81.08%）， unassigned ascomycete fungi （15.13%）， Mrakia （1.74%） and Mycosphaerella （1.02%）. It indicated that Penicillium was the major fungal group on the garlic bolts during the later stage of garlic bolt storage.
　　Key words garlic bolt; fungus; amplicon sequencing; ITS; diversity analysis
　　蒜薹是中國獨有的蔬菜品種，是大蒜Allium sativum L.抽出的幼嫩花莖，由薹梗和薹苞組成。由于其鮮嫩可口，深受廣大消費者青睞。據統計，2015年中國蒜薹年貯量約94.255萬t，是國內外貯藏量最大的單一蔬菜品種[1]。受蒜薹低溫休眠與春化栽培生理的局限，蒜薹生產通常只能秋播春收每年一季，采收后通過低溫氣調保鮮供應全年。但貯藏期蒜薹腐爛常導致許多貯藏庫蒜薹損失高達30%～40%。明確貯存期間導致蒜薹腐爛的病原真菌種類迫在眉睫[2]。
　　擴增子測序就是通過PCR擴增，將目標區域DNA富集后進行高通量測序。對Internal transcribed spacer （ITS）區域進行測序，可以實現環境微生物中真菌多樣性分析[3]。MiSeq測序系統采用邊合成邊測序的技術，每次運行最多能產生超過7 Gb的數據。目前采用MiSeq平臺對ITS的測序，具有測序深度高、利于鑒定群落中低豐度物種以及費用低的特點，已成為研究真菌群落多樣性的首選之策[4]。本文通過提取貯藏后期蒜薹表面真菌的基因組DNA，采用高通量測序的方法對ITS的擴增子進行測序，對貯藏后期蒜薹中真菌的群落組成及多樣性進行了分析。
　　1 材料和方法
　　1.1 樣品采集
　　貯藏蒜薹樣品的采集地點為山東省濟寧市金鄉縣魚山鎮億客隆冷庫，冷庫容積為3 800 m3，貯藏溫度控制在-0.4～-0.8℃，平均濕度控制在70%～80%，蒜薹貯藏方式為貨架式，共19層，層間距為38 cm，蒜薹總儲藏量為280 t。蒜薹來自濟寧市金鄉縣及周邊12個鄉鎮的蒜薹農業種植戶，品種為‘金鄉紅薹’，入庫時間為2017年5月3日～5月11日，每天蒜薹入庫量為30～40 t，蒜薹梢朝外放置，由上至下、由內向外依次擺放于貯存架上，直至庫滿。蒜薹經過預降溫后裝入65 cm×110 cm的蒜薹專用硅窗袋中，每個硅窗袋存放19～20 kg蒜薹。2017年12月在此冷庫東、西、南、北、中五點隨機采樣，鑒于冷庫存儲量巨大，又隨機選取2份樣品，共計7份，編號為A、B、C、D、E、F、G。每份樣品的采集量為1 kg，保留完整的蒜薹整體（薹體和薹梢），0℃條件下保存，送樣至上海天昊生物科技有限公司進行真菌群落組成分析。
　　1.2 試驗方法
　　1.2.1 貯藏期蒜薹發病率調查
　　蒜薹在貯存過程中薹體霉爛就失去商品價值，所以對貯存蒜薹發病率的調查使用病梢率法。對A～G 7個采集樣品的貯藏蒜薹隨機抽取200根用于發病率的調查，每個樣品3個重復，統計被侵染的蒜薹數量，計算發病率。
　　發病率=發病數量調查數量×100%。
　　調查數據用SPSS軟件進行處理，用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析。
　　1.2.2 基因組DNA提取
　　蒜薹樣品使用無菌水振蕩洗脫表面微生物，洗脫液經離心，取沉淀進行DNA抽提，采用CTAB法提取基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至20 ng/μL[5]。 　　1.2.3 7個樣本的ITS1區域擴增
　　對7個樣本ITS1區域[3]進行高保真PCR擴增（MiSeq Reagent Kit v3，Illumina， USA），使用特異引物Primer F（Illumina adapter sequence 1+CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和Primer R（Illumina adapter sequence 2+GCTGCGTTCTTCATCGATGC），擴增體系以及擴增程序參照Mukherjee等[6]的方法。擴增體系為：樣本DNA（20 ng/μL）2.5 μL，Primer F（1 μmol/L）5 μL， Primer R（1 μmol/L） 5 μL，2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL，共25 μL。擴增程序為：95℃ 預變性 3 min;95℃ 變性 30 s，55℃ 復性 30 s，72℃ 延伸 30 s，25個循環;72℃ 延伸 5 min。
　　每個擴增產物取5 μL 與帶有Index 序列的引物（Nextera XT Index Kit， Illumina），通過高保真PCR 向文庫末端引入特異性標簽序列。擴增體系以及擴增程序參照Mukherjee等[6]的方法。體系為：Index Primer 15 μL，Index Primer 25 μL，PCR mix 25 μL，無菌水補足至50 μL。擴增程序為：95℃ 預變性 3 min;95℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，8個循環;72℃ 延伸 5 min。PCR產物為樣本的原始文庫。
　　1.2.4 PCR產物混樣與純化
　　PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用試劑盒 （MiSeq Reagent Kit v3， Illumina， USA）回收目的條帶。根據瓊脂糖凝膠電泳的初步定量結果，對已經帶有各自Index標簽的樣本文庫進行3～5倍稀釋，然后利用Qubit3.0對文庫進行精確定量，根據不同樣本的測序通量要求，按相應摩爾比例混合樣本。
　　1.2.5 文庫制備、庫檢與上機測序
　　混樣后的文庫通過生物分析儀（Agilent 2100 Bioanalyzer，USA）檢測測序文庫插入片段的大小，確認在120～200 bp 之間無非特異性擴增，并準確定量測序文庫濃度。采用Miseq平臺（上海昊天生物技術有限公司）2×250 bp的雙端測序策略對文庫進行測序。
　　1.3 數據分析方法
　　1.3.1 數據質控與統計
　　對原始下機數據進行質控和過濾：使用TrimGalore軟件去除序列末端質量低于20的堿基并去除可能包含的adapter序列，之后去除長度小于100 bp的短序列;使用Flash軟件（V1.2.7，http：∥ccb.jhu.edu/software/FLASH/）將雙末端測序得到的成對序列進行拼接，得到merge序列，進一步去除merge后低質量序列（超過90%的堿基質量低于20）;使用Mothur軟件（https：∥www.mothur.org/）查找并去除序列中的引物，刪除包含N堿基/homopolymer超過6 bp的序列;使用usearch去除總堿基錯誤率大于2的序列以及長度小于100 bp的序列，得到質量和可信度較高的優化序列（clean reads），該數據將用于后續生物信息分析。
　　1.3.2 OTU聚類和物種注釋
　　使用UPARSE軟件（http：∥www.drive5.com/usearch/）去除singleton序列，以97%的相似性對序列進行聚類，相似度大于97%的序列將聚為同一個OTU（operational taxonomic units），同時使用denovo模式去除嵌合體序列，最終產生的OTU代表序列將用于后續物種注釋。使用Mothur軟件將每條OTU代表序列與Unit數據庫進行比對完成OTU分類學注釋，并分析各樣本在分類水平統計中的群落組成。
　　1.3.3 真菌物種α多樣性分析
　　采用Chao l、Shannon、Simpson、覆蓋度等對蒜薹表面真菌OTU進行α多樣性分析。
　　2 結果與分析
　　2.1 冷庫貯藏蒜薹發病率
　　對采集的樣品進行發病率統計（表1），結果表明7個樣本的發病率均在7%以上，E樣品的發病率最高，為11.17%，統計結果表明7個樣本之間的差異不顯著（P>0.05）。
　　2.2 真菌ITS序列數據統計
　　A～G 7個樣本經Illuminate Miseq平臺高通量測序共得到2 418 016條clean reads，總堿基數585 923 487 bp，得到51個OTUs，拼接后的序列平均長度在249.80 bp。各樣本的Raw reads、Merge、Primer 和Clean reads 統計如表2所示。
　　2.3 蒜薹樣本真菌群落組成分析
　　使用R軟件（MathSoft，USA）以UNITE數據庫為參比，對Clean reads進行分類，樣品中鑒定到的真菌分為2門8綱15目21科27屬。子囊菌門真菌占比達到97.54%，而擔子菌門真菌只占2.46%。對A～G 7個樣本中平均占有率>1%的優勢菌綱進行統計（表3），從大到小為散囊菌綱Eurotiomycetes（81.08%）、錘舌菌綱Leotiomycetes（15.21%），銀耳綱Tremellomycetes（2.46%）和座囊菌綱Dothideomycetes（1.07%）。除Tremellomycetes綱，其他三個綱均為子囊菌門真菌Ascomycota。A～G 7個樣品中，優勢菌綱占有率稍有差異，但最優勢菌綱均為Eurotiomycetes。 　　對A～G 7個樣本中平均占有率>1%的優勢菌屬進行統計（表4），優勢菌屬有青霉屬Penicillium、未知子囊菌、耐冷海洋嗜殺酵母Mrakia、小球殼屬Mycosphaerella、低溫酵母屬Cystofilobasidium、假裸囊菌屬Pseudogymnoascus和耐冷酵母屬Guehomyces。A～G 7個樣品中，Penicillium平均占比81.08%，E樣本中占比最大，為94.48%，占比最少為C樣本（61.60%）。酵母屬真菌雖整體平均占比>1%，但不是所有樣品中都有檢出，Mrakia在樣本A、C、E中未檢出;Cystofilobasidium在樣本G中未檢出;Guehomyces在樣本A、C、E中未檢出。表明子囊菌門真菌為貯藏蒜薹上普遍存在的真菌種類，而青霉屬是最優勢菌種。
　　對蒜薹表面真菌的OTU在屬水平上進行了Heatmap展示（圖1），各屬在7個樣品中分布存在差異。樣品A和B、D和E的真菌群落組成相似度更高，被分別聚類到一個分支，而其他樣品則單獨聚為一支。7個樣品的優勢真菌均為青霉屬真菌。
　　2.4 7個樣品真菌物種α多樣性分析
　　真菌的稀釋曲線（圖2）、香農指數曲線（圖3）表明，隨著序列條數的增加，曲線趨于平緩，表明測序數據量合理，基本覆蓋樣品中的類群。
　　3 討論
　　蒜薹貯藏病害的已有研究主要涉及蒜薹表面致病菌的分離鑒定和生物學特征[78]，關于蒜薹表面真菌群落結構組成尚未見報道。本研究利用高通量DNA測序技術分析了山東濟寧金鄉冷庫貯藏蒜薹樣品的真菌多樣性，結果共得到2 418 016條raw reads，51個OTUs。通過OTU物種注釋和物種豐度聚類，最終得到主要的真菌組成為：子囊菌門和擔子菌門;優勢真菌屬組成為： Penicillium、Mrakia、Mycosphaerella、Cystofilobasidium、Pseudogymnoascus、Guehomyces。不同樣品蒜薹表面真菌組成相似，其中，以青霉屬真菌占有率最高，酵母也有一定的占有率。
　　與以往報道相比，本研究中灰霉Botrytis cinerea和匍柄霉Stemphylium solani等主要致病菌并未大量檢出。究其原因可能為：① 青霉屬真菌的生物學特性適應貯存條件。青霉菌可以在0～50℃的范圍內生長，并保持致病能力。趙淑艷等[7]的研究表明青霉菌對蒜薹有致病性，致病性略低于灰霉菌和匍柄霉菌。蘇建紅等[9]的研究表明在低溫條件下青霉菌可侵染貯藏期洋蔥，而且無傷也可侵染，可見低溫條件下青霉依然保有侵染能力。7個樣品的發病率無顯著差異的結果也表明，占有率最高的青霉屬是此次調查的貯藏蒜薹上的主要真菌類群。②青霉菌對防治藥劑產生抗性。王金龍[10]對湖北省柑橘致病青霉進行咪鮮胺抗藥性分析，發現78株指狀青霉中有25株為抗性菌株，占比32%。而咪鮮胺是蒜薹冷庫貯存的首選藥劑。本試驗中所采樣本為生產中正常處理的樣本，藥劑熏蒸或藥劑蘸梢等防治方式有效抑制了其他致病菌的發展，但對青霉菌的抑制效果不佳，也直接導致了貯藏蒜薹的發病率升高。
　　青霉屬真菌是低溫貯藏類果蔬的主要致病真菌，冬棗、柑橘、枸杞等水果的低溫貯藏中均有發現青霉屬真菌[1113]。青霉菌侵入果肉組織后，首先破壞了果實細胞壁的纖維素，進而將果實細胞的果膠質、蛋白質、淀粉、有機酸、糖類等分解為簡單的物質，給酵母和細菌創造了生長的條件，使之得以大量繁殖。本研究中大量檢出了耐冷酵母，與趙瑩等[12]對貯藏后期的柑橘果實中分離到多種酵母的報道相一致。蒜薹經過微生物的侵染繁殖后，表面長出青灰色霉層，表皮組織變軟、凹陷，并產生各種酸味、臭味，從而失去商品價值。
　　高通量測序方法可檢測出培養法無法檢出的難培養真菌，還確定了樣品中大多數真菌的相對豐度，更直觀地揭示了貯藏后期蒜薹表面真菌的群落組成，為下一步真菌的分離、鑒定及致病性測定提供了方向，也為防治藥劑的篩選提供了理論基礎。
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　　（責任編輯：田 喆）
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