通腑泄熱方對膿毒癥大鼠肺功能與外周血T淋巴細胞亞群的影響

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　　摘要 目的：探究通腑泄熱方對膿毒癥大鼠肺功能與外周血T淋巴細胞亞群的影響。方法：選取SPF級SD大鼠120只，隨機分成6組，分別為空白對照組、假手術組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、中藥中劑量組，每組20只，空白對照組大鼠常規喂養，假手術組大鼠行開腹、取出盲腸后放回腹腔并縫合切口的操作，模型組與中藥組大鼠行盲腸結扎穿孔術制作膿毒癥模型。各中藥組大鼠分別于造模成功后6 h、18 h、30 h、42 h給予相應劑量湯劑灌胃。觀察48 h后各組大鼠一般情況，并取大鼠動脈血檢測外周血T淋巴細胞亞群并進行血氣分析。結果：假手術組大鼠各數據指標與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），而模型組死亡率明顯高于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05），采用中高劑量通腑泄熱方灌胃干預可提高大鼠生存率;模型組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細胞的表達水平較空白對照組低，差異有統計學意義（P<0.05）;中藥低劑量組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細胞的表達水平與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;中藥中劑量組與高劑量組大鼠CD3+、CD4+、CD8+細胞的表達水平高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;模型組PaO2明顯低于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05），PaCO2則明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;中藥低劑量組大鼠PaO2明顯高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），PaCO2則較模型組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）;中藥中劑量組與中藥高劑量組大鼠PaO2明顯高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），PaCO2則明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），但2組間數據比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論：通腑泄熱方可有效保護膿毒癥大鼠肺功能，降低膿毒癥相關性肺損傷，并在一定劑量范圍內起到調節外周血T淋巴細胞亞群水平的作用。
　　關鍵詞 膿毒癥;T淋巴細胞亞群;肺功能損傷;通腑泄熱方;大鼠
　　Abstract Objective：To investigate the effects of Tongfu Xiere Decoction on lung function and peripheral T lymphocyte subpopulations in septic rats.Methods：A total of 120 SPF SD rats were randomly divided into 6 groups：the blank control group，the sham-operation group，the model group，the low-dose Chinese medicine group，the high-dose Chinese medicine group and the medium-dose Chinese medicine group，with 20 rats in each group.The blank control group rats were only fed routinely.Rats in the sham-operation group were only laparotomized，had their caeca removed and placed back into the abdominal cavity，and the incisions sutured.The sepsis models were established by cecal ligation and perforation in the model group and the Chinese medicine groups.The rats in each TCM group received gavage of decoctions at the corresponding dose 6 h，18 h，30 h，42 h respectively after successful model establishment.After 48 hours，the general condition of rats in each group was observed，their arterial blood was sampled for the detection of the peripheral blood T lymphocyte subpopulations，as well as for the blood gas analysis.Results：Compared with the blank control group，there was no statistical significance between the sham-operation group and the blank control group（P>0.05），while the mortality of the model group was significantly higher than that of the blank control group（P<0.05）.The gavage intervention of high-dose Tongfu Xiere Decoction could improve the survival rate of rats; the expression levels of CD3+，CD4+，CD8+ cells in the model group were lower than that in the blank control group（P<0.05）.The expression levels of CD3+，CD4+ and CD8+ cells in peripheral blood of rats in the low-dose group presented no statistical significance compared with those in the model group（P>0.05）.The expression levels of CD3+，CD4+，CD8+ cells in the middle-dose group and the high-dose group were higher than those in the model group（P<0.05）; the PaO2 level in the model group was significantly lower than that in the blank control group（P<0.05），while the PaCO2 level was significantly increased（P>0.05）.The level of PaO2 was significantly higher in the low-dose group than that in the model group（P<0.05），while the level of PaCO2 was significantly lower than that in the model group（P>0.05）.The PaO2 levels of the middle-dose Chinese medicine group and the high-dose Chinese medicine group of were significantly higher than that of the model group（P<0.05）while the PaCO2 levels were significantly lower（P>0.05），but no statistical significance was shown between those 2 groups（P>0.05）.Conclusion：Tongfu Xiere Decoction can effectively protect the lung function of septic rats to reduce sepsis-related lung injury，and it plays a role in regulating the level of T lymphocyte subpopulations in peripheral blood within a certain dose range. 　　Key Words Sepsis; T lymphocyte subsets; Pulmonary function impairment; Tongfu Xiere Decoction; Rats
　　中圖分類號：R289.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.024
　　膿毒癥（Sepsis）發病過程中由于致病微生物及其裂解或分泌的毒素在機體內蓄積，可直接損傷機體組織細胞[1]，并引發全身性炎性反應綜合征（System Inflammatory Response Syndrome，SIRS），大量炎性細胞被激活并釋放大量炎性反應遞質入血，導致炎性反應失控并間接損傷機體臟器組織[2]，隨著病情發展可出現多器官衰竭綜合征、膿毒性休克等，臨床膿毒癥相關性死亡率高達28%～50%[3]。而在膿毒癥早期，往往先出現膿毒癥相關性急性肺損傷與急性呼吸窘迫綜合征，是導致患者死亡的主要原因之一[4]。臨床研究表明，膿毒癥所誘導的全身性炎性反應并不僅僅是大量釋放炎性反應遞質，隨著膿毒癥發展可出現T淋巴細胞凋亡，機體出現免疫抑制后無力清除體內感染病菌，也是膿毒癥死亡的主要原因[5-6]。中醫強調辨證論治治療膿毒癥療效好，本研究所用通腑泄熱方具有清熱解毒、攻里通下之功效，臨床治療膿毒癥患者效果顯著，但關于該方劑對機體免疫功能的報道研究較為少見，故本實驗選用本院常用湯劑通腑泄熱方對膿毒癥大鼠進行干預，并觀察該方劑對膿毒癥大鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響，探究其對膿毒癥相關性肺損傷的保護作用。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 動物
　　選取SPF級雄性SD大鼠120只（由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證SCXK（粵）2008-0020）體質量150～210 g，干預前進行適應性飼養1周，實驗前1天晚上停止喂食，自由飲水。
　　1.1.2 藥物
　　按照成人組方用量配制通腑瀉熱方，主要方劑組成：虎杖30 g、地膽草30 g、生大黃10 g、芒硝10 g、山梔子10 g、龍膽草5 g、忍冬藤15 g、萊菔子10 g，除芒硝外，其余中藥分別用水浸泡30 min，其余六味后加熱煎煮30 min，大黃后下，煎煮沸騰后濾取煎液，復渣再次煎液合并，納入芒硝并加濕充分溶解。紗布過濾，濾液水浴蒸發濃縮至含生藥1、2、4 g/mL 3種不同的劑量后放置4 ℃冰箱保存備用。
　　1.2 方法
　　1.2.1 分組與模型制備
　　選取SPF雄性大鼠120只，隨機分為6組，每組20只，分別為空白對照組、假手術組、模型組，空白對照組除常規喂養外不做任何干預，假手術組只行開腹、取出盲腸并放回后關腹的操作。大鼠術后均在大鼠背部皮下注射生理鹽水以補充手術中大鼠體液丟失，并起到抗休克的作用。模型組大鼠制備步驟SD大鼠經腹腔注射10%水合氯醛35 mg/kg麻醉后腹部剃毛消毒，鋪無菌洞巾。沿腹正中線作1.5 cm切口，沿著回腸找到盲腸，在盲腸根部進行結扎，結扎長度約0.8 cm，避免結扎回腸盲腸以及系膜血管。用18G注射器針頭貫通穿刺盲腸2次，并用5-0縫合線穿過系好，防止針孔閉合。將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術畢。立即動物皮下注射生理鹽水10 mL/kg以補充術中體液丟失并抗休克。術后禁食8 h，自由飲水。
　　1.2.2 給藥方法
　　中藥組大鼠分別按成人（60 kg體質量）劑量轉換系數為0.018，于造模后6 h，18 h，30 h，42 h給予4.5 g/（kg·d）中藥灌胃。其余3組則在相應時間點給與生理鹽水灌胃。
　　1.2.3 檢測指標與方法
　　記錄各組大鼠生存情況后，對各組存活大鼠均采用腹腔注射40 mg/kg水合氯醛麻醉后，沿著腹正中線切口進入腹腔并用手術鉗推開腹腔小腸后暴露腹主動脈，采集5 mL腹主動脈血后分離血漿，外周血T淋巴細胞亞群則將血液樣本處理有采用細胞流式儀進行檢查。并取動脈血行血氣分析檢測。
　　1.3 統計學方法
　　采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，其中計數資料以率表示，采用χ2檢驗，計量單位采用均數±標準差（±s）表示，組間兩兩比較采用q檢驗，多組數據間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。
　　2 結果
　　2.1 各組大鼠生存情況比較
　　空白對照組大鼠與假手術組大鼠未見大鼠死亡，存活率為100%;手術后48 h，模型組大鼠死亡14只，存活率為30.00%;中藥低劑量組大鼠死亡11只，存活率為45.00%，與模型組存活率比較，差異無統計學意義（P>0.05）;中藥中劑量組與高劑量組均死亡7只，存活率為65.00%明顯高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。
　　2.2 各組大鼠外周血中T淋巴細胞亞群比較
　　假手術組大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+細胞的表達與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;模型組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細胞的表達較空白對照組低，差異有統計學意義（P<0.05）;中藥低劑量組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細胞的表達水平與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;中藥中劑量組與高劑量組大鼠CD3+、CD4+、CD8+細胞的表達高于模型組（P<0.05），但2組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
　　2.3 各組大鼠血氣比較
　　假手術組大鼠的PaO2、PaCO2與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），模型組PaO2明顯低于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05），PaCO2則明顯升高（P>0.05）;中藥低劑量組大鼠PaO2明顯高于模型組，PaCO2則較模型組降低，差異有統計學意義（P<0.05）;中藥中劑量組與中藥高劑量組大鼠PaO2明顯高于模型組，PaCO2則明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），但2組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。 　　3 討論
　　現代臨床生理病理研究發現機體免疫系統對膿毒癥的應答可而分為2個部分，早期高炎性反應期與后期免疫抑制期[7]。時間較短的高炎性反應時期，在這個時期機體固有免疫成員參與并產生強烈的免疫應答[8]，大量活化的巨噬細胞、中性粒細胞等向肺部募集，并產生大量的炎性反應遞質損傷肺部細胞，并產生組織炎性反應[9-10]，但并不是單純的促炎性反應，同時還有相應抗炎反應以減弱炎性反應遞質的作用，唐榮等[11]通過觀察膿毒癥及膿毒癥急性腎損傷患者外周靜脈血T淋巴細胞亞群的水平變化，發現膿毒癥及膿毒癥急性腎損傷患者存在著不同程度的細胞免疫失衡，表現為循環CD3+T、CD4+T細胞百分比和CD4+T/CD8+T比值的下降。故可認為肺部T淋巴細胞亞群的變化是導致肺部發生繼發性損傷的主要因素之一。
　　而中醫藥復方主要通過多成分、多途徑、多靶點、多機制綜合復雜調控發揮治療作用，治療膿毒癥所致的多器官多系統疾病有明顯療效。中醫古籍醫書中并未有“膿毒癥”的記載，而現代醫師多根據膿毒癥發病時的臨床特征將其歸類為熱毒內蘊、正氣內虛、腑實不通、瘀血阻滯等辨證分型[12]。我們通過長時間的觀察，內毒外邪入侵是導致膿毒癥發病的主要原因，故選取腑泄熱方作為研究方劑，該方主要功效有清熱解毒、通里攻下[13]。研究結果顯示，假手術組大鼠各數據指標與空白對照組比較，差異無統計學意義，說明手術操作并不影響大鼠肺功能與體內T淋巴細胞亞群水平。模型組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細胞的表達水平較空白對照組低，根據造模條件，膿毒癥相關性炎性反應高峰應在造模后12 h時，由于選取的時間點為造模后48 h，相當于膿毒癥后期，也就是免疫抑制期，該時期模型組PaO2明顯低于空白對照組，PaCO2則明顯升高，說明肺功能受到明顯的損傷。戴凌燕等[14]認為CD4+T淋巴細胞具有抑制中性粒細胞聚集的作用，環節肺部炎性反應，程婷婷等[15]對膿毒性誘導的急性肺損傷小鼠支氣管肺泡灌洗液及肺部組織中的促炎性反應遞質、趨化因子水平及肺組織髓過氧化物酶活性進行觀察，發現B和T淋巴細胞衰減因子可通過激活肺部炎性細胞增加小鼠肺通透性，肺部中性粒細胞募集促使肺細胞凋亡。說明T淋巴細胞在肺部聚集有利于肺的保護作用[16]。但隨著機體大量消耗能量物質，代謝負荷加重，大量固有免疫細胞凋亡，這種高強度炎性反應慢慢下降[17]，若此時機體免疫系統調節失衡，髓性抑制細胞增加、Treg細胞增殖、免疫細胞耗竭可導致機體進入膿毒癥后期免疫抑制期，在這個時期T淋巴細胞受到抑制或程序性死亡，導致機體無力清除體內病原菌，加重臟器損傷[18-19]，死亡率大大增加。陳浩等[20]采用祛瘀解毒益氣方治療膿毒癥患者胃腸功能障礙，發現方中大黃具有瀉熱通腸、逐瘀通經，保護腸胃功能的重要作用，降低腸壁血管壁的通透性以防止腸道細菌產生的內毒素進入血液循環中，達到治療的效果。采用藥物干預后雖然中藥低劑量組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+細胞表達與模型組比較，差異無統計學意義，但中藥中劑量組與高劑量組大鼠CD3+、CD4+、CD8+細胞表達高于模型組，且中藥給藥各組大鼠肺血氣指標均較模型組有所改善，說明通腑泄熱方可起到明顯的肺保護作用，并在一定劑量范圍內起到調節T淋巴細胞免疫作用。方劑組成中的生大黃、萊菔子、地膽草、虎杖等諸味中藥均有確切的抗菌、抗炎反應[21]，劉大全等[22]采用主要組成為大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草的清熱解毒方通過抑制致病菌的繁殖而對膿毒癥起到治療作用。且生大黃、芒硝、山梔子具有調節免疫、增加腸蠕動，抑制腸內水分吸收，促進排便的作用，治療膿毒癥相關炎性反應的同時調節腸胃運化功能[22]，忍冬藤與龍膽草均有清熱解毒，燥濕瀉肝的功效，諸藥齊下可起到清熱解毒、祛濕清邪的功效[23]。
　　但通腑泄熱方中各味藥物在體內調節T淋巴細胞的主要作用機制仍不明確，有待進一步深入探究。
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　?。?018-06-28收稿 責任編輯：楊覺雄）
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