健脾清化方對單側輸尿管梗阻模型大鼠P38MAPK信號通路的影響

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　　摘要 目的：觀察健脾清化方對單側輸尿管梗阻模型大鼠P38MAPK的影響，并探討其作用機制。方法：SD雄性大鼠90只，隨機分為假手術組，模型組，西藥組和中藥組，行UUO術制備單側輸尿管模型，并于術后7、14、21 d處死大鼠。生化法檢測大鼠血肌酐、尿素氮;HE、Masson染色觀察腎臟病理形態;WB測腎組織p38、p-p38、TGF-β1蛋白表達;免疫組化法觀察腎組織p38蛋白陽性面積率。結果：與正常組比較，模型組SCr、BUN含量、p38、p-p38、TGF-β1表達、p38陽性面積率均升高（P<0.01，P<0.05）;與模型組比較：氯沙坦鉀組和健脾清化方組SCr、BUN含量、p38、p-p38、TGF-β1蛋白表達、p38陽性面積率均降低（P<0.01，P<0.05）。HE、Masson示模型組腎小管明顯擴張，腎盂腎盞明顯擴張。結論：健脾清化方能改善單側輸尿管梗阻模型大鼠的腎臟病理改變，對腎臟損害有一定的保護作用，其機制可能與其能下調SCr、BUN的含量、p38、p-p38、TGF-β1的蛋白表達有關。
　　關鍵詞 健脾清化方;單側輸尿管梗阻模型;p38 MAPK信號通路;大鼠;實驗;影響
　　Abstract Objective：To observe the effects of Jianpi Qinghua decoction on P38MAPK in rats with unilateral ureteral obstruction and explore its mechanism.Methods：A total of 90 male SD rats were randomly divided into a sham operation group，a model group，a western medicine group and a traditional Chinese medicine group，and the unilateral ureteral model was made by UUO surgery，and the rats were sacrificed at 7，14 and 21 days after surgery.The serum creatinine and urea nitrogen were detected by biochemical method; the pathological morphology of kidney was observed by HE and Masson staining; the expression of p38，p-p38 and TGF-β1 in renal tissue was measured by WB; the positive area ratio of p38 protein in renal tissue was observed by immunohistochemistry.Results：Compared with the normal group，the content of SCr，BUN，the expression of p38，p-p38，TGF-β1 and the positive area ratio of p38 protein in the model group were all increased（P<0.01，P<0.05）; Compared with the model group，the content of SCr，BUN，the protein expression of p38，p-p38，TGF-β1 and the positive area rate of p38 in both the western medicine group and the Jianpi Qinghua decoction group were all decreased（P<0.01，P<0.05）.HE and Masson showed that the renal tubules and the renal pelvis in the model group were significantly expanded.Conclusion：Jianpi Qinghua decoction can improve the renal pathological changes in the model rats with unilateral ureteral obstruction，which has a certain protective effect on kidney damage，and the mechanism may be related to down-regulate the protein expression of SCr，BUN，p38，p-p38 and TGF-β1.
　　Key Words Jianpi Qinghua decoction; Unilateral ureteral obstruction model; P38 MAPK signaling pathway; Rats; Experiment; Effect
　　中圖分類號：R256.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.001
　　腎小管間質纖維化是多種病因所致慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）進展至終末期腎病的最后共同通路。腎功能的惡化，很大程度上取決于腎小管間質纖維化的程度[1]。單側輸尿管梗阻（Uni-lateral Ureteral Obstruction，UUO）模型是經典的腎小管間質纖維化的動物模型，為目前常用的腎間質纖維化模型[2]。p38MAPK屬于MAPK（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）家族中的一個亞族，是廣泛存在于細胞漿內的含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白質激酶。有研究表明[3]，p38MAPK在各種急慢性的炎性反應過程中均能被被活化并參與炎性反應的形成與持續發生。其活化與炎性反應過程中的熱、痛、敏有著緊密的聯系[4]，p38MAPK介導了多種細胞內信息的傳遞過程，能對許多細胞外刺激產生相應的反應，能從胞質移位至細胞核，進而調節轉錄因子的表達活性來改變相關基因的表達水平，從而介導了細胞生長、發育、分化及死亡的全過程[5]。 　　健脾清化方治療腎衰的主要病機在于“中氣式微、陰火乘土、正虛與濕熱濁毒膠著對壘、三焦壅塞”，其以益氣健脾、清熱利濕為組方原則，本課題組已有研究[6]證實其不僅能改善慢性腎衰病程中胃腸道不適癥狀，且能有效降低血肌酐、血脂等腎功能指標，具有切實可信的臨床價值。本研究從p38MAPK信號通路觀察健脾清化方對單側輸尿管梗阻腎病模型大鼠的治療及其作用機制。為研究健脾清化方對p38MAPK介導單側輸尿管梗阻腎病模型大鼠的具體影響，本研究檢測大鼠血肌酐、尿素氮，腎臟p38、p-p38、TGF-β1的蛋白表達量，HE染色觀察大鼠腎臟形態學改變，免疫組化法觀察大鼠腎臟p38MAPK的陽性面積，以期探討健脾清化方對單側輸尿管梗阻腎病模型大鼠腎衰的影響及其作用機制，為健脾清化方治療單側輸尿管梗阻、改善腎臟血流動力學提供實驗依據。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠90只，體質量（200±20）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號SCXK（滬）2013-0016，專用標準顆粒飼料、水喂養，大鼠均分籠喂養，每籠5只，人工光循環，一天內光照與黑暗時間均為12 h，濕度為（55±2）%，溫度為（21±2）℃。實驗在上海中醫藥大學實驗動物中心設施內進行[SYCK（滬）2013-0016]。所有的操作均按照上海中醫藥大學動物實驗倫理委員會要求進行，本實驗研究實驗倫理委員會批準編號：SZY201710012。
　　1.1.2 藥物 中藥由黨參15 g、生黃芪15 g、黃連3 g、制大黃9 g、草果仁6 g、蒼術10 g組成，購自上海中醫藥大學附屬曙光醫院（上海同濟堂藥業有限公司）。上述中藥加水浸泡1 h，武火煮沸轉文火繼續煎煮30 min，將藥液濾出;再次加水煮沸后文火煎煮30 min，濾出藥液，2次藥液混合后煎煮濃縮至600 mL，保證濃縮液中生藥濃度為1.93 g/mL，高壓滅菌后放入4 ℃冰箱保存備用。氯沙坦鉀片（杭州默沙東制藥有限公司，批號J20130048）。
　　1.1.3 試劑與儀器 兔多克隆p38MAPK、p-p38MAPK抗體;鼠多克隆抗體TGF-β1（Abcam，美國）;無水乙醇、石蠟（國藥集團化學試劑有限公司）;PVDF膜（Millipore公司）;ECL化學發光液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇海門市碧云天研究所）;5417R型離心機3K15（Eppendorf，德國）;Synergy2型多功能酶標儀（Bio-Tek，美國）;mini-protein tetra cell 1658004型小型垂直電泳槽（Bio-Rad，美國）;FluorChem M型自動成像分析儀（ProteinSimple，美國）;Hitachi7080型全自動生化儀（Tokyo，日本）;TP1020型生物組織自動脫水機、2255型全自動切片機（萊卡，德國）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 分組與模型制備 將90只大鼠隨機分為假手術組（n=18）、UUO模型組（n=72）。1）假手術組：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，麻醉后切開左側腹腔，鈍性分離輸尿管后，將腎臟回納，逐層縫合關閉腹腔。2）UUO模型組：大鼠麻醉及其他手術操作同前，分離輸尿管后，于近腎臟側1/3處用4～0號手術線結扎，再于遠離腎臟側1/3處結扎，防止尿液返流，生理鹽水沖洗血液后消毒，將腎臟回納，逐層縫合關閉腹腔。造模結束后將模型組大鼠隨機分為模型組、中藥組（健脾清化方）、西藥組（氯沙坦鉀片），每組24只。
　　1.2.2 干預方法 造模后健脾清化方組灌胃量為生藥19.3 g/（kg·d），氯沙坦鉀組為33.3 g/（kg·d），假手術組和模型組分別予等體積的生理鹽水每天灌胃。4組大鼠分別于灌胃7、14、21 d后分批（n=6）處死。大鼠在第7、14、21天時，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉后打開腹腔，進行腹主動脈取血，將血液置于碎冰上暫存，夾閉動脈摘取左側腎臟，去除腎包膜后縱向剖開腎臟，生理鹽水洗凈血液和潴留的尿液后，將其中1/2腎臟置于4%多聚甲醛溶液中室溫保存，另外1/2腎臟放入凍存管，置液氮中暫存，后轉置于-80 ℃冰箱保存備用。
　　1.2.3 檢測指標與方法
　　1.2.3.1 血肌酐（Serum Creatinine，Scr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）的測定 血液采集后離心取上清，用常規生化方法檢測血肌酐、尿素氮。
　　1.2.3.2 腎小管間質纖維化指數 腎臟組織病理，手術側腎臟置入4%多聚甲醛，浸泡24 h后，常規脫水，石蠟包埋，將包埋后的腎臟制成3 μm厚度的切片，脫蠟制水后，1）常規HE染色，每組大鼠制片6張，隨機選取6個互不重疊視野，光鏡下觀察大鼠腎小管和腎間質病理改變;2）Masson染色，每組8張切片在200倍鏡視野下觀察6個互不重疊間質視野，采用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件，對染色結果進行圖像采集和半定量分析。評分標準：0分：正常;1分：陽性面積<1/4;2分：陽性面積在1/4～1/2之間;3分：陽性面積>1/2。
　　1.2.3.3 Western Blot法檢測P38、P-P38、TGF-β1在腎臟組織的表達 從冰箱中取出腎臟，稱取各組同等重量腎臟組織，放入提前配置后的裂解液中，將組織勻漿后離心取上清液，即為腎臟組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，酶標儀讀取蛋白濃度。根據蛋白濃度定量結果，取各組蛋白樣品，加入適量的RIPA、上樣緩沖液，使蛋白樣品為均一濃度。蛋白樣品經10%SDS-PAGE電泳后，取出凝膠進行轉膜，100 V恒壓轉膜90 min，加封閉液搖床10 min，4 ℃過夜孵育一抗，TBST洗膜后分別加入稀釋的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌后，使用凝膠圖像分析系統進行顯色分析。利用Image J軟件分析灰度值，進行半定量分析，計算出目的條帶與內參條帶灰度值的比值，作為樣品蛋白水平的相對表達量。 　　1.2.3.4 免疫組化法觀察肺組織p38MAPK蛋白表達 石蠟切片常規脫蠟至水，PBS洗滌3次;用pH 6.0檸檬酸緩沖液（CB）熱誘導修復，室溫自然冷卻后洗滌3次;0.3%H2O2抑制內源性過氧化物酶室溫20 min;PBS洗滌3次;20%正常羊血清室溫孵育30 min;滴加p38MAPK一抗（1∶200）37 ℃孵育2 h;PBS洗滌3次;EnVision試劑（HRP/R）37 ℃ 30 min;PBS洗滌3次;DAB顯色8～12 min;蘇木素襯染色，熱水藍化;吹干后，樹脂封片;鏡下觀察，背景呈紫藍色，陽性產物呈棕黃色或黃色。采用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件，對免疫組化結果進行圖像采集和定量分析。高倍鏡下每張切片隨機選擇不相重疊的6個視野，計算每例樣本蛋白染色陽性面積率（陽性細胞面積÷總面積）作為比較參數。
　　1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。實驗結果以均數±標準差（±s）表示，組與組之間采用單因素方差分析。任意2組患者之間若滿足正態分布且方差齊，采用獨立樣本t檢驗;若方差不齊，需校正方差分析;若不符合正態分布，則用非參數檢驗Kruskal-Wallis H方法，以P<0.05為差異有統計學意義。
　　2 結果
　　2.1 一般情況觀察 假手術組大鼠術后精神狀況良好，活動自如，被毛光澤，進食良好，體質量隨時間緩慢增長，實驗過程中未死亡。模型組、西藥組、中藥組大鼠均出現不同程度精神不振，喜靜懶動，被毛蓬亂無光澤，體質量不隨時間均勻增長;與模型組、西藥組比較，中藥組大鼠飲食稍增多，體質量略重;實驗過程中，由于操作不當及造模的病理損害，模型組死亡3只，西藥組死亡2只，中藥組死亡2只。
　　2.2 觀察大鼠腎臟組織形態學表現 取材時可見，手術側大鼠腎臟表面有囊狀隆起，顏色深紅，體積增大，觸摸有波動感，剖開腎臟可見大量血性膿性積液，腎盂腎盞破壞消失，僅殘留少量腎皮質。1）HE染色結果顯示：假手術組腎小球、腎小管結構基本正常，無明顯炎性反應細胞浸潤。與假手術組比較，模型組腎小管明顯擴張，呈不規則狀，甚至融合成空洞，腎小管刷狀緣完整性被破壞;腎盂腎盞明顯擴張，集合管、遠曲小管擴張呈囊狀甚至消失;腎間質有大量炎性反應細胞浸潤，纖維組織增生;腎小球數量減少，形狀不規則，在造模后21 d大鼠腎臟切片中，高倍視野下僅見少量殘余腎小球，且有硬化和球管融合。與模型組比較，氯沙坦鉀組、健脾清化方組腎小管擴張程度減輕，炎性反應細胞浸潤程度減輕。見圖1。2）Masson染色結果顯示：假手術組腎小管間質無明顯纖維化改變，腎小球無異常。模型組腎小管擴張，管腔內有脫落壞死的上皮細胞，間質內炎性細胞侵潤，主要為淋巴細胞和單核巨噬細胞;腎小球體積增大，形狀不規則;氯沙坦鉀組和健脾清化方組腎小管擴張及萎縮減輕，間質內纖維化組織和炎性細胞減少，殘余腎小球形態完整規則。見圖2。膠原陽性染色面積可見：與假手術組比較，7 d、14 d、21 d模型組陽性面積率均顯著增高（P<0.01）;與模型組比較：氯沙坦鉀組和健脾清化方組陽性面積率均降低（P<0.01，P<0.05）。見表1。
　　2.3 檢測大鼠血肌酐、尿素氮水平 與假手術組比較，造模后7 d、14 d、21 d模型組血肌酐升高（P<0.01，P<0.05）;與模型組比較，造模后14 d、21 d健脾清化方組與氯沙坦鉀組血肌酐降低（P<0.05），造模后7 d健脾清化方組無差異，氯沙坦鉀組降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與假手術組比較，造模后7 d、14 d、21 d模型組血尿素氮顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，造模后造模后7 d、14 d、21 d健脾清化方組和氯沙坦鉀組血尿素氮均降低，差異有統計學意義（P<0.01，P<0.05）。見表2。
　　2.4 Western Blot法檢測P38、P-P38、TGF-β1在腎臟組織的表達 與假手術組比較，模型組p38、p-p38、TGF-β1表達均升高（P<0.05，P<0.01），且隨著時間增加表達逐漸升高;與模型組比較，氯沙坦鉀組、健脾清化方組p38、p-p38、TGF-β1表達均降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。見圖3。
　　2.5 免疫組化法觀察肺組織p38MAPK蛋白表達免疫組化染色結果顯示，p38MAPK陽性表達呈棕黃色或棕褐色，主要位于細胞漿、帶有一些核著色。p38MAPK在假手術組切片中，表達較少，呈陰性表達（-）。而在單側輸尿管梗阻模型組切片中，其表達明顯增多，呈弱陽性表達（+），彌漫或散在分布;主要分布在小管及間質等部位。西藥組和中藥組P38MAPK的表達較模型組少。見圖4。陽性面積率可見：與假手術組比較，模型組陽性面積率明顯升高（P<0.05，P<0.01），且隨著時間增加，陽性面積率亦升高;與模型組比較，氯沙坦鉀組和健脾清化方組陽性面積率均降低（P<0.05，P<0.01）。見表3。
　　3 討論
　　腎臟纖維化是所有形式的終末期腎?。‥SRD）最終方向，也是多種腎臟疾病最終導致終末期腎病的主要途徑和共同的病理改變[7]。而腎臟纖維化的產生是由于多種原因導致細胞外基質過度沉積，超過了腎臟自身代償的清除能力，最終造成腎病終末期不可逆的病理改變[8]。單側輸尿管梗阻模型是經典的腎小管間質纖維化的大鼠模型，以腎小管的損傷變性和間質內成纖維細胞的增生為主要病理基礎，其具有造模時間短，造模嚴重程度可控性好的特點，能夠較好地模擬慢性腎衰竭的腎臟纖維化的病理過程[9]。鄒朝霞[10]等認為，在間質纖維化進展過程中，腎纖維化程度與腎小管上皮細胞凋亡數量息息相關，上皮細胞凋亡的數量越多，纖維化程度就越重，而在纖維化進程中，腎小管的擴張及后期的萎縮也會進一步導致腎小管上皮細胞的凋亡。本研究中，HE染色結果顯示：模型組腎小管明顯擴張，呈不規則狀，甚至融合成空洞，腎小管刷狀緣完整性被破壞;腎盂腎盞明顯擴張，集合管、遠曲小管擴張呈囊狀甚至消失;腎間質有大量炎性反應細胞浸潤，纖維組織增生;腎小球數量減少，形狀不規則，在造模后21 d大鼠腎臟切片中，高倍視野下僅見少量殘余腎小球，且有硬化和球管融合。Masson染色結果顯示：假手術組腎小管間質無明顯纖維化改變，腎小球無異常。模型組腎小管擴張，管腔內有脫落壞死的上皮細胞，間質內炎性細胞侵潤，主要為淋巴細胞和單核巨噬細胞;腎小球體積增大，形狀不規則;氯沙坦鉀組和健脾清化方組腎小管擴張及萎縮減輕，間質內纖維化組織和炎性細胞減少，殘余腎小球形態完整規則。 　　健脾清化方是上海曙光醫院蔡淦教授根據多年臨床實踐精心組方而成的治療慢性腎衰病程中脾腎同病癥狀的復方，體現了“從脾論治”的中醫治則治法，其具有斡旋中土以利下焦開合，剛柔并濟以救樞機乖戾之臨床價值。馬曉紅等[11]觀察健脾清化方對5/6腎切除大鼠模型的影響，結果表明健脾清化方可明顯降低5/6腎切除大鼠24 h尿蛋白量、降低尿素氮、肌酐水平，表明該方具有改善腎切除大鼠腎功能的作用。徐蝶衣等[12]認為，健脾清化方能夠延緩慢性腎衰的機制主要在于其能改善腎衰患者臨床癥狀及腎臟功能，調節細胞免疫，減慢腎臟纖維化的進展速度，改善腎臟微炎性反應狀態以及糾正腎性貧血等方面，且中藥制劑具有不良反應較小的優勢，顯示出良好的前景。本研究也表明健脾清化方與單側輸尿管梗阻模型組大鼠在肌酐、尿素氮水平差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），但隨著梗阻時間的延長，肌酐、尿素氮的水平仍有增長。
　　促絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）是細胞內廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超家族，是傳遞細胞信號的重要物質。近年來研究發現，在天然免疫和特異性免疫應答中MAPK信號轉導通路均起著重要的調節作用。p38MAPK是MAPK超家族中重要的一員，與機體炎性反應的發生、細胞生長周期的長短、細胞分化的速率、凋亡及腫瘤的發生有著密切的關系。激素、G蛋白偶聯受體、氧化應激反應等許多因素均能激活p38MAPK信號通路[13-14]。同時作為p38MAPK下游的轉化生長因子（TGF-β）也參與了單側輸尿管梗阻模型大鼠腎纖維化的病理過程，其主要介導和調節免疫、炎性反應，其中TGF-β1是被認為是促進腎小球和腎間質纖維化的最重要的細胞因子之一[15]。婁強等[16]認為，順鉑誘導急性腎損傷模型中，p38MAPK的磷酸化促使機體產生酸性的外部環境，并增加凋亡相關蛋白的剪切和表達，而p38MAPK抑制劑可降低細胞凋亡，減少凋亡相關蛋白的激活并減輕細胞外環境的酸度，提示p38MAPK在順鉑誘導的急性腎損傷中發揮重要作用，并可作為潛在的治療藥物性腎損傷的藥物靶標。本研究表明，行單側輸尿管梗阻術后大鼠p38、p-p38、TGF-β1的蛋白表達量均升高，而健脾清化方組大鼠p38、p-p38、TGF-β1的蛋白表達量相對降低，表明健脾清化方可以通過降低p38MAPK信號通路的活化表達減輕腎臟炎性反應，從而改善腎臟病理狀態，達到治療目的。本研究中，健脾清化方無不同劑量分組，其量效關系有待進一步研究。
　　可見，單側輸尿管梗阻刺激可活化p38MAPK，并促使其磷酸化，同時可激活下游TGF-β1，促使機體發生了一系列炎性反應和病理形態改變，進一步導致腎臟纖維化的發生發展，引起機體的疾病狀態。綜合各項實驗結果，我們發現健脾清化方可調控該通路的關鍵蛋白以及相關轉化生長因子的表達，而這也可能正是健脾清化方防治單側輸尿管梗阻腎病的機制之一，為本病的臨床辨治與靶標判定提供方向。
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