來氟米特長效注射劑的制備方法
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摘 要 目的：以poloxamer P407和P188為凝膠基質，制備一種適宜皮下注射的長效緩釋制劑。方法：以膠凝溫度、黏度和溶蝕速率為指標，采用Box-Behnken響應面法優選原位凝膠配方。結果：根據擬合結果使用poloxamer P407和P188分別為21.63%和2.41%時，膠凝溫度為34.99 ℃、黏度48.07 cP、溶蝕時間4.47 h，結合固體分散體技術得到釋放平穩、7 d累積釋放率可達80%以上的皮下原位凝膠注射劑。結論：該模型具有高度顯著性，優選處方可以滿足長效緩釋注射劑的要求。
關鍵詞 poloxamer 原位凝膠 溶蝕 Box-Behnken響應面法
中圖分類號：R944.1； R979.5 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）11-0061-05
Preparation of leflunomide long-term release injection
XIE Song*
?。–entral Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）
ABSTRACT Objective： To prepare a long-term release subcutaneous injection based on poloxamer P407 and P188. Methods： The gelation temperature， viscosity and dissolution rate were taken as dependent variables and the Box-Behnken response surface method was used to optimize the in situ gel formulation. Results： According to the fitting results， when poloxamer P407 and P188 were used at 21.63% and 2.41%， the gelatinization temperature was at 34.99 ℃， the viscosity was 48.07 cP， and the dissolution time was 4.47 h. Combined with solid dispersion technology， the in situ gel injection has it stable release rate for 7 days， and finally obtained more than 80% accumulative release. Conclusion： The model was highly significant. The optimized formulation can meet the requirements of long-term release injection.
KEY WORDS poloxamer； in situ gel； dissolution； Box-Behnken response surface method
類風濕性關節炎（RA）屬于自身免疫性疾病。是一種發病緩慢、伴隨炎癥的關節疾病，多發于四肢關節[1]。來氟米特是一種免疫調節劑，通常用于治療RA，其結構為異噁唑類，通過化學合成而得。該藥在國內外已上市多年，為口服固體制劑。其代謝產物特立氟胺有兩個作用：一是通過抑制二氫乳清酸脫氫酶的活性從而阻斷嘧啶的從頭合成途徑，影響DNA和RNA的合成；二是可抑制酪氨酸激酶的活性和細胞的粘附，并能抑制抗體的產生和分泌[2]。該藥臨床應用兼具良好的安全性和有效性。
以泊洛沙姆（poloxamer）為基質制備的原位凝膠屬溫度敏感型。其不同比例的溶液在感受溫度變化時會產生溶膠-凝膠之間的可逆轉變。又因非毒性和溶液穩定性，使其非常適合作為注射劑的載體[3]。本研究通過Box-Behnken響應面法優選滿足皮下注射要求的原位凝膠配方，同時采用固體分散體技術調節釋藥速率從而達到小劑量來氟米特局部給藥一周一次的目的。
1 材料與方法
1.1 儀器
UV-1700紫外分光光度計（島津儀器（蘇州）有限公司）；RV10旋轉蒸發儀（艾卡（廣州）儀器設備有限公司）；SHA-B數顯恒溫水浴振蕩器（常州國華電氣有限公司）；DV-Ⅲ旋轉式黏度計（美國博勒飛公司）；CP-225D型電子天平（德國賽多利斯集團）。
1.2 試藥
來氟米特（南京康滿林化工實業有限公司，批號20160301）；乙基纖維素（瀘州北方化學工業有限公司，批號20160403）；poloxamer P407（批號WPWJ554C）、poloxamer P188（批號WPYJ540B）均購自巴斯夫（中國）有限公司；甲醇、乙醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 空白凝膠配方優選
1）空白凝膠的制備 應用冷溶法[4]，按處方量量取純化水，冷藏過夜，取處方比例P407和P188緩慢加入上述冷水中，冷藏至完全溶解，備用。
2）凝膠優選配方評價指標 鑒于項目開發目的是對患處進行局部注射并達到迅速膠凝、長效緩釋的目的。故選用膠凝溫度（25 ℃）、黏度和溶蝕速度為評價指標。
3）膠凝溫度及黏度測定方法[5] 取空白凝膠液20 ml置于Brookfield旋轉黏度計測試杯中，選取18號轉子，設定轉速100 r/min，溫控程序為4～40 ℃，升溫速率0.5 ℃/min，黏度突然上升時的拐點溫度即為膠凝溫度，取25 ℃時的黏度為凝膠黏度。 4）溶蝕速率測定方法[6] 取空白凝膠液5 ml于玻璃試管中，稱重，置于調整到適宜膠凝溫度的恒溫水浴振蕩器中使之完全膠凝，加入與凝膠相同溫度保溫的pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液（PBS）3 ml，振蕩，設定頻率為50 Hz，計時，間隔30 min取出將PBS全部傾出，稱取剩余凝膠重量，補加等量的保溫PBS，至累積溶蝕量>95%止。減失重量即為溶蝕量。
5）Box-Behnken響應面設計法 以P407和P188含量為響應面分析法的因素[7-8]，分別按-a、-1、0、1、a5水平進行編碼（a取值為1.414），以凝膠溫度、黏度和溶蝕速率為評價指標，進行試驗設計（表1、2）。
1.3.2 來氟米特固體分散體的制備
預試驗發現用優化的空白凝膠配方載藥體外釋放時間達不到預期的7 d，為了減緩釋藥速率，考慮使用水難溶性固體分散體技術對原料進行預處理。
采用溶劑法制備來氟米特固體分散體[9]，稱取乙基纖維素（EC）12 g，溶解于240 ml乙醇中，再加入4 g來氟米特，超聲使溶解。從5% EC-來氟米特溶液中回收乙醇、將殘余物真空干燥，得來氟米特固體分散體。
1.3.3 載藥凝膠制備
1.3.3.1 體外釋放測定方法
按配方制備空白凝膠，冷藏備用。取稱取來氟米特置于上述空白凝膠中，混合均勻，制成3 mg/ml載藥凝膠。取上述載藥凝膠5 ml置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中使之完全膠凝，然后加入37 ℃ PBS 3 ml，開啟振蕩，頻率50 Hz，并開始計時，固定間隔時間取樣。取樣時將PBS全部傾出容器中，補加等量的37 ℃ PBS。從取出的溶液中移取1 ml置于25 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，UV測定來氟米特含量。
1.3.3.2 載藥凝膠含量測定方法
1）來氟米特甲醇溶液紫外吸收特征的確定 精密稱取來氟米特1 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，搖勻，得濃度10 mg/ml來氟米特溶液。以甲醇溶液為空白對照，按紫外-可見分光光度法在190～400 nm波長范圍內進行掃描，確定其在甲醇中的最大吸收波長。
2）標準溶液的配制 精密稱取來氟米特5.47 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，搖勻，得濃度54.7 mg/ml的儲備液。分別移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1.0、1.6、2.0、2.5 ml儲備液于10 ml容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為0.547、1.094、2.188、3.282、4.376、4.923、5.47、8.752、10.94、13.675 mg/ml的溶液。
3）標準曲線的繪制 以甲醇溶液為空白對照，于波長260 nm處測定不同濃度標準溶液的吸光度。以吸光度對濃度（mg/ml）作線性回歸，當濃度為0.547～13.675 mg/ml時得來氟米特于甲醇溶液中的回歸方程y=0.068x+0.005 4，R2=0.999 0。
2 結果
2.1 響應面設計法擬合結果分析
使用Design expert 8.0.5b對試驗數據運行處理。方差分析結果顯示，模型具有高度的顯著性，且失擬項不顯著，對于膠凝溫度和黏度擬合度較好，溶蝕時間擬合度稍差（表3）。
對應的等高線圖和3D效應面圖見圖1、2。
1）優化 以上述模型為基礎，設定膠凝溫度35℃、黏度<100 cP、溶蝕時間最大化，經design expert 8.05b 運行優化，得結果為：當A=0.46，B=-1，即P407 21.63%，P188 2.41%時，膠凝溫度為34.99 ℃、黏度48.07 cP、溶蝕時間4.47 h，可信度88.36%。
2）驗證 根據優化結果進行三次重復驗證試驗，同時選取實驗序號2、11為參照。結果見表4。
結果顯示：①雖然對照實驗11#溶蝕速率最慢（圖3），但凝膠黏度大不利于注射（圖4）；②優化方案實驗結果與設計比較接近，在室溫環境中黏度小于100 cP利于注射時的吸液和推注，在進入皮下后能迅速膠凝。
2.2 來氟米特固體分散體含測及差示掃描量熱法（DSC）鑒定結果
采用上述紫外法測定來氟米特固體分散體含量結果為103.8%，DSC檢驗結果顯示來氟米特與EC兩者完全熔合（圖5）。
2.3 載藥凝膠體外釋放實驗結果
取制備好的來氟米特固體分散體適量，配制成3 mg/ml載藥凝膠20 ml，按體外釋放測定方法和載藥凝膠含量測定方法測定含量。
結果顯示，使用固體分散體技術可以顯著降低藥物釋放速率，7 d累積釋放達到80%，呈線性（y=11.248x-11.978，R2=0.998 7），滿足來氟米特一周給藥一次的臨床要求。
3 討論
溫敏型原位凝膠是一種新的藥物裝載和釋放系統。在儲存時低黏度的液體，給藥后可迅速在給藥部位形成固態的凝膠[10]，相比于口服固體制劑具有制備工藝簡單、藥物分散均勻、給藥方便可實現緩釋的優點[11]。
Box-Behnken試驗設計常用于在確信試驗因素對試驗指標存在非線性影響時對因素與指標間的關系進行試驗分析，尤其是在要求試驗的各因素不能同時在高水平設置下進行試驗時。本試驗基于：①人體基礎體溫37 ℃，又需皮下注射的特點，設計評價指標分別是膠凝溫度35℃[12]，膠凝溫度太高可能注射后不能迅速形成原位凝膠、膠凝溫度太低可能在夏季室溫比較高的情況下在注射前即產生膠凝。②注射劑一般要求注射液能通過常規針頭吸液并推注時阻力不易過大，因而設計黏度小于100 cP，考慮載藥后黏度會增加，因此優化后的空白凝膠黏度為50 cP，載藥后黏度為67 cP，吸液和推注都比較方便，同時也為今后提高載藥量預留空間。③優選配方溶蝕速率穩定在10%左右，顯示固體分散體結合原位凝膠技術可以達到調控藥物釋放的目的，實現長效緩釋。后續擬進行動物體內藥代試驗，根據結果可通過調整EC與來氟米特比例調節釋放度。
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