狗牙根誘變后代抗寒性評價

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　　摘  要  通過電解質外滲法和匍匐莖恢復試驗對‘陽江’狗牙根及其12個通過形態鑒定選出的坪用價值高且花序密度低的誘變后代進行抗寒性鑒定。電解質外滲法結果表明：誘變后代間的抗寒性具有較大差異，其葉片半致死溫度（LT50）的變異范圍為7.6～0.2 ℃（最低值與最大值相差7.4 ℃）;參試材料抗寒性由強到弱依次為M18>M4>M26>M28> M22>陽江>M29>M31>M10>M37>M16>M1>M25，其中，有5個誘變后代抗寒性優于親本，分別是M18、M4、M26、M28、M22。匍匐莖恢復實驗結果表明：誘變后代M1、M22、M26、M31、M25在0 ℃和5 ℃低溫脅迫后的恢復生長率都高于親本，恢復能力均優于親本;M10、M37、M28在5 ℃低溫脅迫下，恢復生長能力低于親本，抗寒性相對較弱，M16和M4在0 ℃和5 ℃低溫脅迫下，恢復生長率都低于親本，抗寒性明顯弱于親本。綜合2種方法鑒定結果顯示：誘變后代M1、M25的恢復能力較強;M4、M28的葉片抗寒性較好，青綠期較長;M22、M18、M26的葉片抗寒性和匍匐莖恢復能力均較強;M29，M31的葉片抗寒性和匍匐莖恢復能力與親本相似;M10、M16、M37的葉片抗寒性和匍匐莖恢復能力均較弱，整體抗寒性較弱。
　　關鍵詞  狗牙根;誘變后代;電解質外滲法;匍匐莖恢復實驗;抗寒性
　　中圖分類號  S688.4      文獻標識碼  A
　　Abstract  According to morphological identification， 12 mutant progenies of ‘Yangjiang’ Bermudagrass with high turf value and low inflorescence density were selected to identify the cold tolerance by electrolyte leakage rate and stolon regrowth experiments. The electrolyte leakage rate showed that the variation range of LT50 ranged from 7.6 ℃ to 0.2 ℃， and the difference between the minimum and maximum values was 7.4 ℃. It was obvious that the cold resistance of the mutant offspring varied greatly. The order of cold resistance from strong to weak was M18>M4>M26> M28 >M22>Yangjiang>M29>M31>M10>M37>M16>M1>M25. Five of the mutants had better cold resistance than the parents， namely M18， M4， M26， M28 and M22. The results of stolon recovery test showed that the mutant growth rates of M1， M22， M26， M31 and M25 were higher than those of the parents after low temperature stress at 0 ℃and 5 ℃， and the recovery ability was better than that of the parents. Under 5 ℃low temperature stress， the ability to restore growth of M10， M37 and M28 was lower than that of the parents， and the cold resistance was relatively weak. Under low temperature stress of 0 ℃ and 5 ℃， the growth rates of M16 and M4 were lower than that of the parents， and the cold resistance was significantly weaker than that of the parents.The results of the two methods showed that the mutants M1 and M25 had strong recovery ability. M4 and M28 had better cold resistance and longer green period. M22， M18 and M26 had stronger cold resistance and stolon recovery ability. The cold resistance of the leaves of M29， M31 and the recovery ability of the stolons were similar to those of the parents. The cold resistance and the recovery ability of the stems of M10， M16 and M37 were weak， and the overall cold resistance was weak. 　　Keywords  bermudagrass; mutagenized progenies; electrolyte leakage rate; stolon regrowth experiments; cold tolerance
　　DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.006
　　狗牙根[Cynodon dactylon （L.） Pers]是一種耐高溫、耐干旱能力強的多年生暖季型草坪草。狗牙根的根莖和匍匐莖十分發達，且具有再生能力強、耐踐踏、抗旱、色澤鮮艷、質地好、成坪快等優良特性，是我國最重要的暖季型草坪草之一，被廣泛應用于運動草坪、游憩草坪及護坡草坪建植中[1-3]。
　　低溫是限制暖季型草坪草分布和利用的主要因素[4]。狗牙根是典型的暖季型草坪草，其最適生長溫度為26～32 ℃，氣溫低于15 ℃即停止生長，7～10 ℃時變為棕黃色[5-6]，因此，對低溫脅迫的耐受性是評價狗牙根坪用質量的一個重要指標。前人已對狗牙根的抗寒性進行了大量研究報道，Fry等研究發現狗牙根半致死溫度范圍為17.1 ℃至4 ℃[7];Taliaferro 等[8]通過模擬低溫脅迫來研究狗牙根對低溫的耐受性，結果顯示，狗牙根的半致死溫度范圍是-10.3 ℃～5.4 ℃。景艷杰等[9]用電解質外滲法對102份新疆狗牙根和10份疆外狗牙根進行抗寒性評價，結果顯示，疆內和疆外狗牙根葉片平均LT50分別是-14.84 ℃和12.31 ℃，變異系數分別為9.92%和13.88%。通過以上研究可以看出，不同品種的狗牙根及種源間的抗寒性存在較大的遺傳變異。電解質外滲法常用于評估低溫引起的細胞損傷水平，并可以用來評估草坪草的相對冷凍耐受性[10]。Shashikuma等[11]通過電解質外滲法和TTC法評價狗牙根的耐寒性，發現供試品種間抗寒性存在顯著性差異，且電解質外滲法與TTC法實驗結果吻合，說明電解質外滲法可以用來作為評價狗牙根抗寒性的指標。劉燕等[12]用恢復實驗法，來評價國產海雀稗對低溫的耐受性，發現通過測定再生嫩枝的數目來評價植物抗寒性是一種有效的方法。
　　目前國內生產上應用的狗牙根品種多為進口的Tif系列狗牙根，如‘Tifway’、‘Tifgreen’、‘Tifdrawf’等。這類引進品種普遍存在成本高、適應性差、養護水平要求高、應用范圍小等問題。為選育適合我國本土的狗牙根品種，江蘇省中國科學院植物研究所從1993年從國內外大量收集暖季型草坪草種質資源，并開展了一系列的評價工作，選育出優質抗逆的狗牙根新品種‘陽江’狗牙根。但是‘陽江’狗牙根同時也存在花序密度較高的問題，影響坪用質量，并且會增加管理成本。許多研究表明，輻射誘變育種是獲得優良新種質的一種快速有效的育種手段，且輻射誘變在引起形態變異的同時也會改變草坪草的抗逆性。Li等用50Gy和70Gy的60Co γ射線輻照鈍葉草匍匐莖莖節獲得了花序密度低且節間較短的突變體[13];Chen等用200Gy60Co γ射線輻照狗牙根的種子，對誘變后代進行抗旱性鑒定，結果表明，狗牙根輻射誘變后代的抗旱性較親本增強[14];宋華偉等對ZS-SJZ結縷草60Co γ誘變后代進行抗寒性鑒定，發現輻射誘變可以改善結縷草的抗寒性[15]。因此本課題組于2015年以‘陽江’狗牙根的匍匐莖為外植體，開展了輻射誘變育種的工作，通過60Co γ射線進行輻射誘變，單節種植，獲得了42個誘變后代。經過初步形態觀測，從中選出了12個坪用價值高且花序密度低的后代?；謴蛯嶒灧芍苯予b定植物抗寒性，是一種較為簡單的傳統鑒定方法;電導法屬于比較經典的抗寒性鑒定方法，目前采用較多，且操作簡單、可信度高。本研究通過電解質外滲法和低溫脅迫后匍匐莖恢復實驗對這些狗牙根誘變后代進行抗寒性評價，與‘陽江’狗牙根親本進行比較，以明確其抗寒性，為新品系的推廣應用和進一步改良奠定基礎。
　　1  材料與方法
　　1.1  材料
　　本研究的實驗材料為陽江狗牙根[Cynodon dactylon （L.） Pers]及其通過60Co γ射線輻射誘變‘陽江’狗牙根匍匐莖外植體獲得的12個坪用價值高且花序密度低的誘變后代，分別為M1、M4、M10、M16、M18、M22、M25、M26、M28、M29、M31、M37。
　　1.2  方法
　　1.2.1  電解質外滲率測定法  根據郭海林等[16]的方法，采用電導法對葉片的電解質透出率進行測定，4次重復。取供試材料健康植株的葉片，清水沖洗干凈后用去離子水漂洗3次，用濾紙吸干表面水分，將葉片剪至0.2 cm左右長，分成5份，每份1 g，用濕紗布包好置于試管中，在4 ℃冰箱中過夜，第2天在低溫循環儀（Polyscience公司，Model：SD28R-30-A12Y）中進行低溫處理。溫度梯度設為0、5、10、15、20 ℃處理1.5 h，處理后置于4 ℃冰箱解凍，第三天將每個處理分成4等分（4個重復），置于試管中，加入去離子水20 mL，在室溫下浸提。第四天用電導儀（上海雷磁儀器，Model：DDS-307）測定電導率，然后沸水浴15 min，待其冷卻到室溫后，測定其煮沸電導率。
　　電解質外滲率=（冷凍電導率/煮沸電導率）×100%
　　1.2.2  匍匐莖恢復生長實驗  選取13份參試狗牙根生長基本一致的莖尖以下的2～4節共含3節的匍匐莖，進行5個梯度（同葉片處理溫度）的冷凍處理，每個處理用6根匍匐莖。將冷凍處理的材料放在4 ℃冰箱解凍24 h，然后種植在規格為10 cm×10 cm的花盆中（栽培基質為半土半沙），在大棚中進行統一管理。
　　根據Dunn[17]的方法，以冷凍處理后的匍匐莖在恢復生長實驗中長出的嫩枝數目評價其抗寒性。實驗前，統計每個處理6根莖3個節上的潛伏芽數均為36，冷凍材料在種植4個星期后統計每個匍匐莖長出的嫩枝數目（萌芽數），計算恢復生長的百分率，作為評價其抗寒性的指標。 　　1.3  數據處理
　　按照朱根海等[18]、莫惠棟[19]的方法，應用南京農業大學王邵華教授開發的統計軟件Rcpsys進行數據處理。將電腦率擬合Logistic方程： Y=K/（1+aebc），并得出模擬曲線。最后根據方程中的a、b值求得LT50，以評價其抗寒性。
　　2  結果與分析
　　2.1  葉片電解質外滲率測定結果
　　2.1.1  低溫脅迫后電解質外滲率  研究結果表明，供試材料的電解質外滲率的過程呈‘S’型曲線變化，隨溫度的下降，電解質滲出率開始緩慢上升，溫度繼續下降時，電解質滲出率快速上升，而當溫度降低到一定程度時，電解質滲出率逐漸趨于穩定，5個點對應的溫度分別是0 、5 、10 、15 、20 ℃。在0～5 ℃低溫脅迫下，隨溫度的降低，電解質滲出率緩慢升高;在5～10 ℃低溫脅迫下，電解質滲出率快速升高;在10～20 ℃低溫脅迫下，電解質滲出率上升緩慢并逐漸趨于穩定，說明此時葉片已受到最大傷害。半致死溫度為‘S’型曲線的拐點溫度。
　　2.1.2  LT50比較分析  表1為根據供試材料在模擬低溫處理下電解質滲出率求得的Logistic方程及其擬合度和半致死溫度。
　　由表1可見，方程的擬合度均達到了顯著（P<0.05）水平，表明LT50可以作為評價狗牙根抗寒性的依據。從半致死溫度結果可以看出，供試材料的LT50變化范圍為7.6 ～0.2 ℃，最低值與最大值相差7.4 ℃，可見供試誘變后代的抗寒性存在差異。其中，半致死溫度低于5 ℃的有M18（LT50=7.6 ℃）、M4（LT50=7.3 ℃）、M26（LT50=5.4 ℃），葉片抗寒性較強;半致死溫度在5 ～2 ℃之間的誘變后代有M28（LT50= 4.6 ℃）、M22（LT50=3.9 ℃）、M29（LT50= 3.0 ℃）、M31（LT50=3.0 ℃）、M10（LT50= 2.8 ℃）、M37（LT50=2.3 ℃）葉片抗寒性相對較強;半致死溫度高于2 ℃的有M16（LT50= 1.5 ℃）、M1（LT50=1.2 ℃）、M25（LT50 = 0.2 ℃），葉片抗寒性較弱。
　　與親本相比，供試誘變后代中，M29、M31、M10、M37、M16、M1、M25的葉片半致死溫度高于親本，葉片抗寒性弱于親本。其余誘變后代（M18、M4、M26、M28、M22）半致死溫度均低于親本，葉片抗寒性優于親本。由表1可知，供試誘變后代中，M18的半致死溫度最低，為7.6 ℃，較親本低4 ℃，而誘變后代M25的半致死溫度最高為0.2 ℃，較親本高3.4 ℃，由此可見，供試誘變后代的抗寒性與親本存在明顯差異。
　　2.2  匍匐莖恢復生長實驗
　　供試材料匍匐莖萌芽率統計結果見表2，材料順序按照總萌芽率降序排列。
　　由表2可見，所有供試材料在15 ℃冷凍處理后，匍匐莖均不能恢復生長;在10 ℃冷凍處理下有3份誘變后代可以恢復生長，即M4、M26、M28，且恢復生長率均為5.6%，其余材料全部死亡。在0 ℃低溫處理下，所有供試誘變后代均能恢復生長，誘變后代中僅M4和M16的恢復生長率低于親本，其中M4恢復生長率最低，僅有38.9%;M1的恢復生長率最高為83.3%，M25的恢復生長率僅次于M1為72.2%。同樣，在5 ℃低溫下，所有供試材料均能恢復生長，誘變后代中M4、M10、M16、M28和M37的恢復生長率低于親本，M16的恢復生長率最低，為25%，M1的恢復生長率最高為63.9%，M25的恢復生長率僅次于M1為61.1%。
　　綜合以上分析可以得出，誘變后代M1、M22、M26、M31、M25在0 ℃和5 ℃低溫脅迫后的恢復生長率都高于親本，恢復能力均優于親本;M10、M37、M28在5 ℃低溫脅迫下，恢復生長能力低于親本，抗寒性相對較弱，M16和M4在0 ℃和5 ℃低溫脅迫下，恢復生長率都低于親本，抗寒性明顯弱于親本。
　　2.3  葉片半致死溫度（LT50）與匍匐莖恢復生長的關系
　　葉片電解質外滲法結果表明，供試誘變后代中M18、M4、M26、M28、M22的半致死溫度低于親本，其中M18、M4的半致死溫度均低于7 ℃，抗寒性明顯優于親本;誘變后代M29、M31、M10、M37、M16、M1、和M25的半致死溫度（LT50）均高于親本，且M16、M1、和M25的半致死溫度（LT50）均高于2 ℃，抗寒性明顯弱于親本。匍匐莖恢復實驗結果表明：在0 ℃低溫脅迫后僅有M16、M4的恢復生長率低于親本，在5 ℃低溫脅迫后，M28、M37、M4、M10、M16的恢復生長率低于親本。其中，M1、M22、M25、M26、M31在0 ℃和5 ℃低溫下恢復生長率均高于親本，抗寒性明顯優于親本。而M4和M16恢復生長率均低于親本，抗寒性明顯弱于親本。
　　2種方法結果顯示：誘變后代M1、M25在電解質外滲法中表現抗寒性較弱，而在恢復實驗中表現抗寒性較好，而M28和M24在恢復實驗中表現為抗寒性較弱，在電解質外滲法中表現抗寒性較好;M10、M16和M37在2種方法中都表現較弱的抗寒性;M22、M18、M26在2種方法中都表現較強的抗寒性。
　　3  討論
　　植物對低溫的抵抗能力，即抗寒性，是限制狗牙根應用的重要環境因素。測定狗牙根抗寒性常用的4種方法有電導法[20]、恢復實驗法[12]、TNC法[21]、PEGE凝膠法[22-23]?；謴蛯嶒灧ㄝ^為簡單，是一種傳統的直接鑒定法，但外界干擾因素較多，不易控制;電導法目前采用較多，屬于比較經典的測定狗牙根抗寒性的方法，且操作簡單、可信度高;TNC法和PAGE法由于抗寒機理復雜，尚未得到充分揭示。所以，對狗牙根抗寒性的評價大多采用電導法和恢復實驗法。為了提高抗寒性測定結果的準確性，本研究綜合應用電導法和恢復實驗法對‘陽江’狗牙根誘變后代進行抗寒性鑒定，通過對兩種方法實驗結果的比較分析，明確了誘變后代的抗寒能力，為新品系的推廣應用和進一步改良提供基礎。 　　本研究結果表明，半致死溫度（LT50）最低的誘變后代M1（LT50=7.6 ℃）與半致死溫度（LT50）最高的誘變后代M25（LT50=0.2 ℃）較親本（LT50=3.6 ℃）半致死溫度分別相差低4 ℃和3.4 ℃。郭海林等[24]用電解質外滲法對雜交狗牙根60Co γ射線誘變后代進行抗寒性鑒定，結果表明，誘變后代的葉片半致死溫度（LT50）均高于對照，且最高半致死溫度（LT50）與對照相差5.16 ℃。張彥芹等[25]用電解質外滲法對高羊茅誘變后代進行抗寒性評價發現，誘變后代的電解質外滲率與親本差異極顯著，且抗寒性明顯優于親本。由此可見，輻射誘變后代的抗寒性與親本存在明顯差異，且輻射誘變可以改善狗牙根的抗寒性，為狗牙根種質創新奠定了基礎。參試誘變后代半致死溫度（LT50）變化范圍為7.6～0.2 ℃，王志勇等[26]用電導法對國內30份普通狗牙根進行抗寒性評價，得到的半致死溫度（LT50）范圍為6.57～0.29 ℃，與本研究測定的狗牙根LT50變化范圍相當。Anderson等[27]通過測定低溫脅迫后狗牙根再生長量來對不同地區的狗牙根品種進行抗寒性評價，結果發現狗牙根的抗寒性與其地理位置顯著相關，熱帶亞熱帶地區狗牙根抗寒性較弱。供試誘變后代的親本‘陽江’狗牙根原產廣東陽江，所以半致死溫度的試驗結果與親本本身的抗寒性有關。
　　匍匐莖恢復實驗采用與葉片電解質外滲法同樣的溫度梯度，對誘變后代的匍匐莖進行低溫處理，通過潛伏芽恢復生長的百分率來評價其抗寒性。匍匐莖恢復實驗可直接表明誘變后代在低溫脅迫下的恢復生長能力。從結果可以看出，所有供試材料在0 ℃和5 ℃低溫脅迫下均能恢復生長，低于10 ℃均不能恢復生長，郭海林等[10]用恢復實驗法對結縷草雜交后代進行抗寒性評價，結果顯示，所有供試材料在低于6 ℃時，均不能恢復生長，在2 ℃時，參試材料均可恢復生長，可見‘陽江’狗牙根部分誘變后代的恢復生長能力高于結縷草雜交后代。在5 ℃低溫脅迫下，M4、M10、M16、M28、M37的恢復生長率低于親本，其中，M16的恢復生長率最低，僅有25%，抗寒性明顯弱于親本，M37、M4、M10僅次于M16，恢復生長率均為36.1 ℃，抗寒性相對較弱。誘變后代M1、M22、M25、M26、M31在0 ℃和5 ℃低溫脅迫后的恢復生長率均高于親本，其中M1和M25恢復生長率最高，抗寒性最好。
　　由以上分析可知，2種實驗結果并不完全一致，誘變后代M1和M25葉片抗寒性較弱，但在恢復實驗中表現較強的恢復生長能力，說明這2個品種在環境溫度降低時會把葉片的能量轉移到莖內，所以在葉片枯黃之后仍保留較強的恢復能力;誘變后代M28和M4的半致死溫度較低，但在恢復實驗中表現抗寒性較弱，說明這2個品種的青綠期較長，在寒冷期會消耗大量能量來保持葉色，因而匍匐莖中的能量減少，恢復能力變弱;其他誘變后代的半致死溫度結果與恢復實驗吻合，說明在環境溫度降低時葉片和匍匐莖之間能量維持平衡的狀態?；謴蜕L能力和青綠期對于一個草坪草種而言是至關重要的，它決定草坪草的返青狀況和坪用質量，所以應結合電解質外滲法和恢復實驗法從不同層面來對草坪草種的抗寒性進行綜合分析。
　　根據2種方法對狗牙根誘變后代的鑒定結果：誘變后代M1、M25的恢復能力較強;M4、M28的葉片抗寒性較好，青綠期較長;M22、M18、M26的葉片抗寒性和匍匐莖恢復能力均較強;M29、M31的葉片抗寒性和匍匐莖恢復能力與親本相似;M10、M16、M37的葉片抗寒性和匍匐莖恢復能力均較弱，整體抗寒性較弱。此結果將作為今后選取花序密度低且性狀優良的優質狗牙根新品種的依據，為新品系的推廣應用和進一步改良奠定基礎。
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