鐵觀音茶梗中揮發性物質分析
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摘 要 本研究以鐵觀音茶梗為供試材料，采用頂空進樣法-氣質聯用（HS-GC/MS）技術對其揮發性物質進行提取和檢測，利用質譜結合保留指數對其進行定性，并對揮發物種類、相對含量及部分揮發物所具備的生物活性進行比較和探討。結果表明：從安溪鐵觀音茶梗中共檢測出130種化合物， 其中共有的成分108種;采用質譜法（mass spectrometry， MS）完全鑒定出45種、初步鑒定出58種，采用各化合物的保留指數（retention index，RI）鑒定出54種;MS與RI相結合共完全鑒定出68種揮發物。這表明譜庫檢索與保留指數相結合，有利于提高可定性揮發物的數量以及定性的準確度。在梗中，碳氫類化合物、醛、醇、酯的種類和含量都最為豐富，相對含量高于1%的揮發物有24種，部分揮發物具有麻醉、抑菌、抗癌等生物活性作用，其含量占茶梗揮發物總含量的20.51%。該結果為研究茶梗在形成烏龍茶香氣品質中所起的作用及茶梗的綜合利用提供理論基礎。
關鍵詞 安溪鐵觀音;茶梗;HS-GC/MS;揮發物;生物活性
中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A
Abstract The tea stem of Anxi Guanyin was taken as the research object and the volatile substances of stem were extracted and analyzed by headspace sampling-gas chromatography/mass spectrometry （HS-GC/MS）. Its qualitative analysis was achieved by mass Spectrometry （MS） combined with retention index （RI）. The type and relative content of the volatiles and the biological activity of some volatiles were compared and discussed. 130 compounds were detected in the tea stem of Anxi Guanyin， of which 108 were in common. 45 compounds were totally identified and 58 compounds were preliminarily identified by MS， while 54 compounds were identified by RI. 68 compounds were totally identified by MS combined with RI， meaning the combination of MS and RI greatly improved the quantity of qualitative volatiles and accuracy of quality. The types and contents of hydrocarbons， aldehydes， alcohols and esters were the most abundant in the stem. There were 24 volatiles with relative content higher than 1%. Some volatiles， whose content accounted for 20.51% of the total volatile content of tea stem， had biological activities， such as anaesthesia， bacteriostasis， anticancer and et al. The study would provide a theoretical basis for the role of the tea stem in the formation of aroma quality of Oolong tea and the comprehensive utilization of tea stems.
Keywords Anxi Guanyin tea; tea stem; HS-GC/MS; volatiles; biological activity
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.019
制作烏龍茶的鮮葉要求具有一定的成熟度，因而茶青中不僅有葉片，還含有較多的梗。茶梗是一種特殊的可再生生物資源[1]，盡管含有相當數量的香氣物質，但由于茶梗影響茶葉的美觀，同時其茶堿含量偏高，口味較為苦澀，因此，往往被揀出。茶葉加工每年都有大量的茶梗副產品，約占毛茶總重的20%，如果能合理利用，可增加茶葉生產過程的經濟效益[2-3]。
茶梗與茶葉所含的芳香性物質和抗氧化性物質的組成相似。芳香物質不僅影響茶葉的品質，而且也影響茶樹本身及被飲用者的生理代謝。前人研究發現香氣可以調節精神狀態，具有抗菌[4]、鎮靜[5]、止痛[6]、消炎[7]、抗抑郁抗焦慮[8-9]、抗疲勞[10]等作用。因此，茶梗中的揮發性物質可以作為天然的食品添加劑、藥用保健成分、化妝品原料等，從而提高茶產品的附加值。
目前已有學者對茶梗的揮發性物質進行了研究。謝清桃等[1]采用同時蒸餾萃取法提取鐵觀音茶梗浸膏揮發性成分，用GC/MS法分離鑒定出58種揮發性成分，并將浸膏用于卷煙加香，能夠明顯豐富煙香，減小刺激性和改善卷煙余味。袁杰[11]采用SPME-GC/MS對茶梗的香氣和鐵觀音香氣的生物活性等進行了研究。Zeng等[12]對干燥烏龍茶樣及其茶湯的揮發物和糖苷類前體進行感官審評和生化研究，結果表明，梗中茶氨酸和揮發性單萜的積累量比葉子中更加豐富，但茉莉內酯、吲哚和反式橙花醇含量比葉子中少，梗的存在沒有顯著改善茶樣總的香氣特征。 鐵觀音作為閩南烏龍茶的代表，其毛茶含有較多的梗，是研究茶梗揮發物很好的實驗材料。本試驗從安溪不同產地收集了鐵觀音毛茶，以其梗作為研究對象，采用頂空進樣法-氣質聯用（HS-GC/MS）技術對茶梗揮發物進行提取和檢測，對其種類、相對含量及其相關的生物活性進行了統計分析，以期為研究茶梗在形成烏龍茶香氣品質中所起的作用及茶梗的綜合利用提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 茶樣 選取2017年秋季安溪鐵觀音毛茶樣6個，以其梗作為試驗樣并磨碎，過40目篩，裝于鋁箔袋，密封備用。
1.1.2 主要試劑 NaCl（分析純，≥99.5%，上海國藥集團化學試劑有限公司），正構烷烴混合標準品C8-C30（美國o2si公司）。
1.1.3 主要儀器設備 Clarus SQ8T 型氣質聯用儀、Elite-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、TurboMatrix 40 Trap自動頂空進樣器、20 mL頂空瓶（美國Perkin Elmer公司）;電子分析天平（0.0001 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;WK-400B高速藥物粉碎機（山東青州市精誠機械有限公司）;實驗室超純水器（科爾頓水務有限公司）。
1.2 方法
按課題組前期優化的試驗參數進行操作[13]。
1.2.1 茶樣頂空進樣方法 每個茶梗樣設置3個平行，準確稱取0.5 g的茶梗粉（精確至0.0001 g）于20 mL頂空瓶中，加入1 mL的溶于三級水的飽和NaCl溶液，用配有聚四氟乙烯墊的密封蓋密封并按順序放入自動進樣器，以設置好的儀器參數進樣。爐溫（平衡溫度）80 ℃，取樣針溫度100 ℃，傳輸線溫度120 ℃，樣品平衡時間60 min，捕集阱Hi 280 ℃，Lo 40 ℃，保持5 min，干吹1 min，解析0.5 min，頂空瓶壓力40 psi，色譜柱壓力12 psi，解析壓力15 psi，頂空出口分流。
1.2.2 GC-MS條件 升溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至125 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。載氣為高純度 He（99.999%）。電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃，質譜傳輸線溫度250 ℃，質量掃描范圍m/z 45～500。
1.2.3 正構烷烴頂空進樣方法與保留指數計算 準確移取2 μL正構烷烴混合標準品，按與茶梗樣相同的頂空和GC-MS條件進樣，重復3次。記錄每個正構烷烴標準品的出峰時間，求3次重復的平均值。茶梗揮發物各組分的保留指數計算采用Kovats保留指數計算公式[14]：
式中：RI—待測組分的保留指數;RTunknown—待測組分的保留時間;RTn、RTn+1—待測組分前后正構烷烴的保留時間。
1.3 數據分析
通過檢索NIST 2011在線質譜數據庫，核對質譜匹配度并參考相關文獻資料[15-22]，然后再從特征離子、實際成分、保留指數等方面，分別對各峰所代表的揮發性物質的化學結構和名稱加以確認。其相對含量采用峰面積歸一法分析，即以各香氣組分的峰面積占總峰面積之比值表示組分相對含量。
采用SPSS 21軟件對數據進行單因素方差分析（ANOVA）。
2 結果與分析
2.1 安溪鐵觀音茶梗揮發性成分的定性與定量分析
由表1可知，安溪鐵觀音茶梗檢測出來的揮發物總峰面積范圍為365 160 457～396 236 061，平均值為355 260 803，峰個數范圍為115～125，平均值為121.67。
由表2可知，安溪鐵觀音茶梗中共檢測出130種揮發性物質，其中MS完全鑒定出45種，初步鑒定出58種，RI鑒定出54種，MS與RI相結合共完全鑒定出68種揮發物。
6個樣品共有的芳香物質合計108種，包括碳氫類化合物（33種，12.72%）、未知（22種，9.17%）、醛（14種，17.63%）、醇（10種，14.25%）、酯（6種，12.95%）、含氮化合物（5種，6.14%）、氯化物（5種，11.32%）、酮（5種，2.22%）、雜氧類（5種，7.49%）、酚（2種，0.31%）、含硫化合物（1種，2.94%）?？梢钥闯?，在梗中碳氫類化合物、醛、醇、酯不管是種類還是含量都最為豐富。茶梗揮發物中相對含量高于1%的化合物有24種，其相對含量與香氣類型統計結果見表3。
2.2 安溪鐵觀音茶梗中具有生物活性的揮發性成分
茶梗中檢測出來的部分揮發物具有麻醉、抑菌、抗癌等生物活性，可以直接作為藥物或者制備藥物的原料、中間體而應用于醫學領域。經過檢索前人文獻，在茶梗所含的108種共有成分中，除了20種未知化合物及部分檢索不到醫藥相關理化性質和生物活性的化合物外，課題組對剩下的茶梗揮發物進行了功能分類以及種類、相對含量的統計，詳見表4。
其中茶梗中具麻醉作用的揮發物包括一氯甲烷（7.77%）、2-甲基呋喃（0.57%）和β-石竹烯（0.02%）;具抑菌、抗病毒活性的揮發物有吲哚（0.79%）、D -檸檬烯（0.43%）、姜黃烯（0.0.3%）和β-石竹烯（0.0.2%）?；钚匝踝杂苫軌蛞l癌癥、自身免疫性疾病、炎癥、腫瘤、心肌與腦損傷等性
能已被生物醫學界所證實， 因此抗氧化活性與抗癌活性密切相關[23]。茶梗中具有抗癌、抗氧化活性的揮發物有吲哚（0.79%）、D-檸檬烯（0.43%）、水楊酸甲酯（0.09%）、姜黃烯（0.03%）、β-石竹烯（0.02%）。茶梗中具有消炎抗炎活性的揮發物有γ-雪松烯（0.75%）、D-檸檬烯（0.43%）、甲基丁香酚（0.20%）、水楊酸甲酯（0.09%）、姜黃烯（0.03%）和β-石竹烯（0.02%）。茶梗中具有抗抑郁活性的揮發物有順式-β-羅勒烯（1.77%）和β-石竹烯（0.02%）。茶梗中具有鎮痛活性的揮發物有水楊酸甲酯（0.09%）。茶梗中具有止咳祛痰活性的揮發物有D-檸檬烯（0.43%）、甲基丁香酚（0.20%）、愈創木酚（0.09%）、姜黃烯（0.03%）和β-石竹烯（0.02%）。在茶梗中具有鎮靜、抗焦慮、安眠作用的揮發物有甲基丁香酚（0.20%）、正己醇（0.14%）、β-石竹烯（0.02%）。在茶梗中不少揮發物可用作制備醫藥的原料或者中間體。包括異戊醛（2.11%）、苯甲醛（1.71%）、庚醛（1.38%）、甲基庚烯酮（1.18%）、吲哚（0.79%）、苯乙醛（0.63%）、2-甲基呋喃（0.57%）、苯乙腈（0.29%）、對二甲苯（0.25%）、順式-4-庚烯醛（0.17%）、正己醇（0.14%）、α-松油烯（0.11%）和愈創木酚（0.09%）。 可見，在茶梗中有22種具有生物活性的揮發物，且不少揮發物同時兼備多種生物活性，比如D-檸檬烯具有抑菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、消炎抗炎、止咳祛痰等一系列生物活性。這些揮發物的含量之和占茶梗揮發物總含量的18.90%～ 22.93%，平均值為20.51%。
3 討論
本研究從鐵觀音茶梗中共檢測出130種揮發性物質，MS與RI相結合完全鑒定出68種揮發物，效果優于使用單一的定性方法，因此譜庫檢索結合保留指數的定性方法可大大提高定性準確度和可定性物質數量。同時，因為保留指數反映的是化合物與固定相的相互作用，當固定相相同時，這種相互作用僅與化合物的拓撲、幾何和電性特征相關[24-25]，因此本研究定性結果可用于與相同實驗條件下的實驗結果進行比對。
經過比對前人文獻，本研究茶梗中檢測到的與鐵觀音成品茶相同的香氣成分有醋酸乙酯（6）、正己醛（18）、庚醛（35）等40種（表2中有下劃線的物質）[19， 26-29]。鐵觀音茶梗中檢測出的揮發物與鐵觀音成品茶具有相似性，這是由烏龍茶的鮮葉原料要求和加工工藝所共同決定的。制作烏龍茶的鮮葉要求具有一定的成熟度并含有一定量的梗。做青是烏龍茶的特征性工藝也是形成烏龍茶品質特征的關鍵技術，做青包括搖青與晾青，其作用分別是走水、還陽。烏龍茶香氣成分轉化和形成的重要條件和顯著特征之一是，具有一定成熟度的鮮葉在長時間做青過程中使得葉片主要在葉緣損傷變色，逐步適度失水，嫩莖中的內含物通過“走水”輸送至葉細胞以增進香氣的形成，保證內含物轉移和轉化的節奏。因此梗的存在對烏龍茶香氣品質特征的形成是必須的。與茶梗中檢測到的相同成分有9種，包括正己醛（1）、苯甲醛（46）、D-檸檬烯（60）、苯乙醛（65）、順式-β-羅勒烯（66）、苯乙腈（82）、水楊酸甲酯（95）、吲哚（106）、β-紫羅蘭酮（124）[1]。部分在前人文獻中檢測到的梗所含有的香氣成分本研究沒有檢測出，此外本研究檢測出了一些前人文獻中沒有檢測到的揮發物，這可能是因為所選茶樣產地不同、檢測方法與條件不同以及質譜定性能力強弱不同導致的差異。
在鐵觀音茶梗中，碳氫類化合物、醛、醇、酯不管是種類還是含量都最為豐富，其中碳氫類化合物中的不飽和烴往往具有獨特的香型，在茶梗整體香型中所起作用更大，比如D-檸檬烯具有檸檬香，α-柏木烯具木香。醛類化合物閾值很低，對產品的風味貢獻較大[30]。醇類通常具有芳香或酸敗氣味，其中，不飽和醇的風味閾值較低，對風味貢獻較大，如多種萜醇和芳香醇[31]。酯類化合物通常呈現水果香味[32];有的酯類成分，如油酸甲酯、亞油酸甲酯等，它們由高級脂肪酸和低級醇脫水縮合而成，沒有氣味，對茶葉香氣形成幾乎沒有作用[28]。此外，梗揮發物共有成分中相對含量高于1%的化合物包括醋酸乙酯、一氯甲烷、1-戊烯-3-醇等24種，它們大部分具有獨特的香型。但是由于各種香氣成分對檢測器響應校正因子各不相同，供試茶樣各類香氣成分（如醇、醛、酮等）并不具備成分間含量或類內加和可比性。因此，不同來源茶樣某種或某些香氣成分含量的增減變化更值關注[33]。此外有些大量香氣成分對茶葉香型品質貢獻并不很大，其中還存在感管閾值問題[34]。茶葉梗中相對含量大于1%的化學成分列于表3，這些成分雖然不一定是茶梗的特征香氣成分，但以相同的步驟檢測鐵觀音成品茶香氣成分后，可將梗與成品茶中同一物質的相對含量或含量（以峰面積代表）作比較，不僅可為研究做茶過程中梗與茶之間香氣成分的互相轉化提供一定的參考，而且梗中這些含量較高的成分，可被提純應用于醫藥方面以提高茶梗的附加值。
6個茶梗樣的共有成分有108種，其中，含量18.90%～22.93%（平均值為20.51%）的揮發物可用于醫藥，具有麻醉、抑菌、抗癌等生物活性作用。但由于香氣成分總量僅占茶葉干物質總量的0.005%～0.03%，含量極低，這些揮發物發揮麻醉、抑菌、抗癌等活性所需的最低濃度及最適濃度需要后期試驗來進一步確定。
本研究分析了鐵觀音茶梗中所含揮發物的種類及相對含量，并統計分析了部分揮發物所具備的的生物活性，經過與前人文獻比較分析，初步探究了鐵觀音茶梗的揮發物。比較梗、純茶、全茶香氣成分與感官審評之間的差異，進一步了解梗在形成烏龍茶香氣品質中所起的作用，結合體內和體外生物實驗探究茶梗中具生物活性的香氣提取物在醫藥中的作用是接下來的研究方向。
參考文獻
謝清桃， 李建軍， 王坤波， 等. 鐵觀音茶梗浸膏揮發性成分GC/MS分析及在卷煙中的應用[J]. 煙草科技， 2013， 57（7）： 48-50.
謝劍平， 劉惠民， 朱茂祥， 等. 卷煙煙氣危害性指數研究[J]. 煙草科技， 2009， 53（2）： 5-15.
閆克玉. 卷煙煙氣化學[M]. 鄭州： 鄭州大學出版社， 2002.
張 鷹， 王滿生， 曾新安， 等. 金柚柚皮精油提取條件優化及其抑菌性能研究[J]. 食品工業， 2014， 35（5）： 54-58.
周慧秋， 于 濱， 喬婉紅， 等. 甲基丁香酚藥理作用研究[J]. 中醫藥學報， 2000， 28（2）： 79-80.
俞善信， 文瑞明， 熊文高. 對羥基苯甲酸酯合成研究進展[J]. 精細石油化工進展， 2002， 3（1）： 42-45.
李 寅， 陳燕忠. 水楊酸甲酯搽劑的制備及臨床應用[J]. 中國醫院藥學雜志， 1999， 19（3）： 186.
廖圣良. 新型（-）-β-蒎烯衍生物的合成、生物活性和構效關系研究[D]. 北京： 中國林業科學研究院， 2016.
Galdino P M， Nascimento M V， Florentino I F， et al. The anxiolytic-like effect of an essential oil derived from Spiranthera odoratissima A. St. Hil. leaves and its major component， β-caryophyllene， in male mice[J]. Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry， 2012， 38（2）： 276. Fujiwara R， Komori T， Noda Y， et al. Effects of a long-term inhalation of fragrances on the stress-induced immunosuppression in mice[J]. Neuroimmunomodulation， 1998， 5（6）： 318.
袁 杰. 鐵觀音香氣化學成分及活性研究[D]. 泉州： 華僑大學， 2014.
Zeng L， Zhou Y， Fu X， et al. Does oolong tea （Camellia sinensis） made from a combination of leaf and stem smell more aromatic than leaf-only tea？ Contribution of the stem to oolong tea aroma[J]. Food Chemistry， 2017， 237： 488.
王 蔚， 黃旭建， 易國春， 等. HS-GC/MS法分析烏龍茶揮發性成分[J]. 天然產物研究與開發， 2019， 31（2）： 222-229.
Wang Y， Yang C， Li S， et al. Volatile characteristics of 50 peaches and nectarines evaluated by HP-SPME with GC-MS[J]. Food Chemistry， 2009， 116（1）： 356-364.
呂世懂. GC-MS結合化學計量學方法研究茶葉揮發性成分[D]. 昆明： 昆明理工大學， 2014.
王呈仲， 蘇 越， 郭寅龍. 頂空-氣相色譜-質譜聯用分析桂花和葉中揮發性成分[J]. 有機化學， 2009， 29（6）： 948-955.
顧賽麒， 王錫昌， 陶寧萍， 等. 頂空固相微萃取-氣質聯用及電子鼻技術檢測中華絨螯蟹不同可食部位中的香氣成分[J]. 食品科學， 2013， 34（18）： 239-244.
張 亞， 李衛芳， 肖 斌. 25個湖南、陜西茯磚茶樣品揮發性成分的HS-SPME-GC-MS分析[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版）， 2017， 45（2）： 151-160.
張珍珍， 楊遠帆， 孫 浩， 等. 3種清香型鐵觀音揮發性成分及香味特征[J]. 集美大學學報（自然科學版）， 2016， 21（3）： 175-183.
林 杰， 陳 瑩， 施元旭， 等. 保留指數在茶葉揮發物鑒定中的應用及保留指數庫的建立[J]. 茶葉科學， 2014， 34（3）： 261-270.
胡西洲， 彭西甜， 周有祥， 等. 頂空固相微萃取-氣相色譜/質譜法結合保留指數法測定龍井茶的香氣成分[J]. 中國測試， 2017， 43（2）： 55-59.
曾瓊瑤， 龔瑞瑩， 楊海玲， 等. GC-MS結合保留指數法分析云南產胡蘿卜籽揮發油成分[J]. 中成藥， 2016， 38（6）： 1311-1315.
馬建華. 水楊酸甲酯清除羥基自由基活性的研究[J]. 化學通報， 2006， （3）： 228-230.
梁 晟， 李雅文， 趙晨曦， 等. GC-MS結合保留指數對中藥揮發油的定性[J]. 分析測試學報， 2008， 27（1）： 84-87.
蘇 越， 姬厚偉， 蘇式兵， 等. GC/MS中保留指數和保留溫度回歸分析應用于單萜烯結構確認[J]. 分析測試技術與儀器， 2008， 14（3）： 131-135.
降升平， 張小紅， 張玲玲， 等. 4個品種茶葉的香氣成分比較[J]. 食品研究與開發， 2013， 34（15）： 66-70.
李 陽. 安溪鐵觀音揮發性成分指紋圖譜研究[D]. 泉州： 華僑大學， 2016.
呂世懂， 吳遠雙， 姜玉芳， 等. 不同產區烏龍茶香氣特征及差異分析[J]. 食品科學， 2014， 35（2）： 146-153.
姚 逸， 馮 林， 楊 堅， 等. 鐵觀音香氣成分的GC-MS分析[J]. 西南農業學報， 2013， 26（2）： 524-530.
龍卓珊， 徐玉娟， 潘思軼， 等. 固相微萃取結合嗅覺檢測法鑒定廣式臘腸活性風味物質[J]. 食品科學， 2010， 31（8）： 194-198.
謝建春. 現代香味分析技術及應用[M]. 北京： 中國標準出版社， 2008.
馬家津， 呂躍鋼， 張 文. 北京烤鴨香味分析[J]. 北京工商大學學報（自然科學版）， 2006， 24（2）： 1-4.
陳 林， 張應根， 陳 鍵， 等. 清香型烏龍茶品質形成過程中香氣組成化學模式的動態變化規律[J]. 茶葉科學， 2013， 33（1）： 53-59.
苗愛清， 呂海鵬， 孫世利， 等. 烏龍茶香氣的HS-SPME- GC-MS/GC-O研究[J]. 茶葉科學， 2010， 30（S1）： 583-587.
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