HPLC—柱后光化學衍生法測定清火片膠囊中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的含量及其安全性評價

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　　摘 要 目的：建立測定清火片（膠囊）中黃曲霉毒素（AF）G2、G1、B2、B1的方法，并評價該制劑的安全性。方法：采用高效液相色譜（HPLC）-柱后光化學衍生法，并以全國37個廠家生產的266批清火片（膠囊）為樣品。色譜柱為Agilent C18；流動相為水-乙腈-甲醇（V/V/V），梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL；熒光檢測器激發波長為360 nm、發射波長為450 nm。結果：AF G2、AF G1、AF B2、AF B1分別在進樣量為10.197～101.97（r=0.999 7）、10.197～101.97（r=0.999 6）、9.958 6～99.586（r=0.999 1）、9.999 0～99.990（r=0.998 3） pg范圍內線性關系良好；精密度（n=6）、重復性（n=6）、穩定性（12 h，n=5）試驗的RSD均小于3.0%；檢測限分別為0.80、4.00、0.80、4.00 pg；定量限分別為1.60、8.00、1.60、8.00 pg；加樣回收率分別為85%～90%、85%～90%、55%～65%、65%～75%（RSD為1.8%～4.7%，n=6）。在266批樣品中均未檢測出AF G2、AF G1、AF B2、AF B1。結論：該方法可用于清火片（膠囊）中AF的檢測；雖在抽檢樣品中未檢測出AF，但建議增訂AF檢查項，以提高其安全性。
　　關鍵詞 黃曲霉毒素；清火片；清火膠囊；高效液相色譜-柱后光化學衍生法
　　Content Determination of Aflatoxin G2， G1， B2 and B1 in Qinghuo Tablets （Capsules） by HPLC-post- column Photochemical Derivatization and Its Safety Evaluation
　　WANG Yunxia，WANG Juan，XIE Zhimin（Xi’an Institute for Food and Drug Control， Xi ’an 710054， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for content determination of aflatoxin （AF） G2， G1， B2 and B1 in Qinghuo tablets （capsules）， and to evaluate the safety of the preparation. METHODS： HPLC-post-column photochemical derivatization was adopted， and 266 batches of Qinghuo tablets （capsules） from 37 manufacturers as sample. The determination was performed on Agilent C18 column with mobile phase consisted of water-acetonitrile-methanol （V/V/V， gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃. Excitation wavelength and emission wavelength of fluorescence detector were 360 and 450 nm. RESULTS： The linear ranges of AF G2， AF G1， AF B2 and AF B1 were 10.197-101.97 （r=0.999 7）， 10.197-101.97 （r=0.999 6）， 9.958 6-99.586 （r=0.999 1）， 9.999 0-99.990 （r=0.998 3） pg， respectively. RSDs of precision （n=6）， reproducibility （n=6） and stability tests （12 h， n=5） were all lower than 3.0%. The detection limits were 0.80， 4.00， 0.80 and 4.00 pg， respectively. The quantitation limits were 1.60， 8.00， 1.60 and 8.00 pg， respectively. The recoveries were 85%-90%， 85%-90%， 55%-65%， 65%-75% （RSD=1.8%-4.7%， n=6）. AF G2， AF G1， AF B2 and AF B1 were not detected in 266 batches of samples. CONCLUSIONS： This method is suitable for the determination of AF in Qinghuo tablets （capsules）. Although AF was not detected in the sample， it is advisable to add the determination of AF so as to improve its safety.
　　KEYWORDS Aflatoxin； Qinghuo tablets； Qinghuo capsules； HPLC-post-column photochemical derivatization
　　清火片和清火膠囊是2018年國家評價性抽檢品種，兩者雖劑型不同，但處方一致，均由大青葉、大黃、石膏和薄荷腦四味藥材組成，都是用于治療咽喉腫痛、風火目赤等癥的藥物。由于清火片（膠囊）方中的大黃是以生藥粉投料[1-2]，而2015年版《中國藥典》（四部）（后文簡稱藥典）通則黃曲霉毒素（AF）指導原則項下說明：“處方中有以生藥粉投料的中成藥，建議進行AF（以AF G2、AF G1、AF B2和AF B1的總量計）的檢測”[3]。并且，大黃藥材個頭比較大，不易干燥、易霉變，容易受到AF的污染。而AF具有很強的急性毒性，容易誘發肝癌，是目前已知毒性最強的化合物之一，具有確切的“三致”毒性[4-5]。目前，一般對食品及少量中藥材有檢測AF含量的規定，但對中成藥研究還較少。清火片（膠囊）作為國家基本藥物，需求量較大、使用范圍較廣，考慮其安全性，增加AF檢查項具有重要意義。 　　目前，檢測AF的方法主要有高效液相色譜（HPLC）- 柱后光化學衍生法[6-14]、HPLC-三氟乙酸衍生法[15]和HPLC-質譜（MS）法[16-18]等。筆者曾采用三氟乙酸衍生法制備樣品進行HPLC檢測時，發現基質干擾嚴重；HPLC-MS法所用儀器較昂貴，又不易普及；而HPLC-柱后光化學衍生法方便、快捷，不需要任何衍生試劑，可以在線對不具有熒光特性的AF B1、AF G1經過紫外線照射進行羥基化，使其具有熒光性，增加了靈敏度，而其余成分不受影響，進而可通過熒光檢測器同時對4種AF成分進行檢測?；诖?，本研究擬建立HPLC-柱后光化學衍生法測定清火片（膠囊）中4種（G2、G、B1、B3）AF含量，并對全國37個生產企業217批次清火片和49批次清火膠囊進行相關檢測，為控制清火片（膠囊）的安全性以及含大黃生藥粉投料的中成藥的安全性提供參考。
　　1 材料
　　1.1 儀器
　　1260型HPLC儀、1260型熒光檢測器（美國Agilent科技有限公司）；AUraPHRED-8W型光化學衍生器（北京中檢維康生物技術有限公司）；BT124S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ-700VDB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PriboFast IAC型免疫親和柱（青島普瑞邦生物科技有限公司）；TDL-40C型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。
　　1.2 藥品與試劑
　　266批次樣品均為國家評價性抽檢樣品，共涉及吉林、山東、福建、廣西等16個省37個生產企業的產品（217批次樣品為清火片，49批次樣品為清火膠囊），其中清火片有136批次為糖衣片（3個規格：0.19、0.25、0.55 g/片，服用量均為1次6片、1日2次）、81批次為薄膜衣片（7個規格：0.25、0.26、0.31、0.38、0.46、0.50、0.52 g/片，前4種規格服用量為1次6片、1日2次，后3種規格服用量為1次3片、1日2次），清火膠囊（規格：0.5 g/粒，服用量均為1次3粒、1日2次）；AF混合標準品溶液（天津阿爾塔科技公司，批號：ALT060109，標識質量濃度：AF B1、AF B2、AF G1、AF G2分別為10.3、10.3、10.1、10.1 μg/mL，純度：AF B1、AF B2、AF G1、AF G2分別為99.0%、99.0%、98.6%、99.0%）；AF混合對照品溶液（中國食品藥品檢定研究院，批號：LC03983，標識質量濃度：AF G2、AF G1、AF B2、AF B1質量濃度分別為0.329、1.081、0.310、0.977 μg/mL，純度：100.0%）；單標AF G2、AF G1、AF B2、AF B1標準品溶液（農業部環境保護科研監測所，批號：均為201712，標示質量濃度：均為2.0 μg/mL，純度：均為100.0%）；乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。
　　2 方法與結果
　　2.1 色譜條件
　　色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水（A）-乙腈（B）-甲醇（C）（V/V/V），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；熒光檢測器激發波長（λex）為360 nm、發射波長（λem）為450 nm。洗脫程序詳見表1。
　　2.2 溶液的制備
　　2.2.1 混合標準品溶液的制備 精密吸取天津阿爾塔AF混合標準品溶液50 μL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合標準品儲備液。精密吸取上述儲備液2 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合標準品溶液（AF B1、AF B2、AF G1、AF G2質量濃度分別為2.039 4、2.039 4、1.991 7、1.991 7 ng/mL）。
　　2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取1日最大服用量的清火片（膠囊），置于錐形瓶中，加正己烷20 mL，超聲（功率：240 W，頻率：40 Hz）處理10 min，傾去上清液，重復上述操作1次；濾過，濾渣70 ℃水浴蒸干，精密加入90%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率：240 W，頻率：40 Hz）處理20 min，放冷，用90%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心（3 000 r/min）5 min，精密吸取上清液5 mL，置于50 mL量瓶中，加適量水，然后加入10%聚山梨酯20溶液1 mL，再加水稀釋至刻度，搖勻，用玻璃纖維濾紙濾過，棄去初濾液；精密量取續濾液10 mL，過免疫親和柱，用水20 mL洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入將水擠出柱子，再用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干后，精密加入0.5 mL甲醇使溶解，即得供試品溶液。
　　2.3 系統適用性試驗
　　取清火膠囊（批號：170701，前期試驗中未檢出AF）和同批次樣品加標（中檢院AF混合標準品溶液），分別按“2.2.2”項下方法制備AF陰性的供試品溶液和加標供試品溶液。精密吸取以上2種供試品溶液以及“2.2.1”項下AF混合標準品溶液，按“2.1”項下條件進行測定，記錄色譜圖。結果，相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，以AF G2計的理論板數為8 707、以AF G1計的理論板數為 13 423、以AF B2計的理論板數為17 737、以AF B1計的理論板數為20 430，陰性樣品無干擾，結果詳見圖1。
　　2.4 方法學考察
　　2.4.1 線性關系考察 精密吸取天津阿爾塔AF混合標準品溶液10 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成AF G2、AF G1、AF B2、AF B1質量濃度均為10 ng/mL的母液。采用逐級稀釋法，取母液稀釋制備成AF G2、AF G1、AF B2、AF B1質量濃度分別為5、4、2、1 ng/mL的系列樣品溶液。吸取上述5種不同質量濃度樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按“2.1”項下條件進行測定。以進樣質量（c，pg）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，線性關系考察結果見表2。 　　2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.4.1”項下質量濃度為2 ng/mL的天津阿爾塔AF混合標準品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，AF G2、AF G1、AF B2、AF B1峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明儀器精密度良好。
　　2.4.3 重復性試驗 精密吸取“2.3”項下加標供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，AF G2、AF G1、AF B2、AF B1含量的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法的重復性良好。
　　2.4.4 穩定性試驗 精密吸取“2.3”項下加標供試品溶液，放置0、2、4、8、12 h后按“2.1”項下色譜條件進行測定。結果，AF G2、AF G1、AF B2、AF B1峰面積的RSD均小于3.0%（n=5），表明該樣品在12 h內穩定性較好。
　　2.4.5 加樣回收率試驗 取未檢出AF的清火膠囊（批號：170701）6份，各6粒，精密稱定，分別精密加入中檢院AF混合對照品溶液（AF G2、AF G1、AF B2、AF B1質量濃度分別為0.329、1.081、0.310、0.977 μg/mL）50 μL，按“2.2.2”項下方法制成加樣回收供試液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記算AF G2、AF G1、AF B2、AF B1的含量并計算其回收率。結果，AF G2、AF G1、AF B2、AF B1的平均回收率分別為87.7%、86.8%、57.2%、68.4%，RSD為1.8%～4.7%（n=6），結果見表3。
　　2.4.6 檢測限 精密吸取農研監測所標準品溶液AF G2、AF G1、AF B2、AF B1各10 μL，分別置于100、10、100、20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備4種標準品溶液，搖勻；各精密吸取標準品溶液5、10、15 μL于具塞錐形瓶中，分別各加入清火膠囊（批號：170701）粉末（取6粒粉末），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定。結果，在加入標準品溶液10 μL的供試品溶液中峰高最接近3倍信噪比，故AF G2、AF G1、AF B2、AF B1的檢測限分別為0.80、4.00、0.80、4.00 pg。
　　2.4.7 定量限 精密吸取農研監測所標準品溶液AF G2、AF G1、AF B2、AF B1各10 μL，分別置于50、5、50、10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備4種標準品溶液，搖勻；各精密吸取5、10、15 μL標準品溶液于具塞錐形瓶中，分別加入清火膠囊（批號：170701）粉末（取6粒粉末），按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定。結果，在加入標準品溶液10 μL的供試品溶液中峰高最接近10倍信噪比，故確定AF G2、AF G1、AF B2、AF B1的定量限分別為1.60、8.00、1.60、8.00 pg。
　　2.4.8 樣品中AF G2、AF G1、AF B2、AF B1含量測定 對全國16個省37個生產企業的217批次清火片、49批次清火膠囊按照上述方法進行AF G2、AF G1、AF B2、AF B1含量測定。結果，均未檢出AF G2、AF G1、AF B2、AF B1。
　　3 討論
　　3.1 色譜條件的確定
　　在預試驗中，筆者分別選用了等度洗脫和梯度洗脫兩種洗脫方式進行試驗。設置的等度洗脫流動相為甲醇-乙腈-水（30 ∶ 13 ∶ 57，V/V/V）、甲醇-乙腈-水（22 ∶ 13 ∶ 65，V/V/V）。設置的梯度洗脫程序為：（1）以（A）水-（B）乙腈-（C）甲醇為流動相，0～25 min，68%→64%A、16%→18%B、16%→18%C；（2）以（A）水-（B）乙腈-（C）甲醇為流動相，0～35 min，70%→64%A、15%→18% B、15%→18% C。結果，采用以上洗脫方式后出峰時均過快，分離度均低于1.5且峰形不對稱。經過一系列優化后，最終采用正文中梯度洗脫程序，結果顯示峰形對稱、無干擾、分離度好。在選擇進樣量時，筆者首先按藥典方法以2 ng/mL的混合對照品溶液分別進樣5、10、15、20、25 μL，進行標準曲線的繪制，發現在進樣量為5、10 μL時峰形對稱，而進樣量為15、20、25 μL時峰形不對稱；接著筆者又將混合對照品溶液的質量濃度調整為1 ng/mL，同法進樣，出現了上述相同現象；再接著筆者又將混合對照品溶液的質量濃度增至10 ng/mL，同法進樣，仍然發現進樣量為5、10 μL時峰形對稱（對稱度在0.95～1.05范圍內），而進樣量為15、20、25 μL時峰形不對稱。根據以上考察結果，進樣量應控制在10 μL及10 μL以下。
　　3.2 供試品溶液處理方法的確定
　　在預試驗中，筆者首先采用了藥典方法[3]進行樣品處理，但用該供試品溶液進樣后，圖譜結果顯示基質干擾較大，圖譜分離度差，無法分析。筆者考慮原因可能是因為大黃藥材中具有熒光特性的成分較多，且多與目標成分共存，故干擾較大。鑒于上述情況，筆者對供試品溶液的制備條件進行了以下篩選和優化：（1）利用AF不溶于正己烷的特性，而大黃中具有熒光特性的成分易溶于正己烷，故選擇以正己烷除去大黃里的熒光特性成分，最終除去干擾；（2）由于該品種處方中的大青葉是采用水煎制備，水溶性成分干擾過大，故選擇了用90%甲醇超聲提取樣品，可以去除大部分水溶性雜質的干擾；（3）利用10%聚山梨酯20的助溶性，稀釋液中加入1 mL 的10%聚山梨酯20，過柱水洗后可以很好地去除目標成分峰左右的小雜質峰；（4）過免疫親和柱時選擇不加壓，靠重力作用使樣品緩慢通過免疫親和柱，這樣就有充分的時間使樣品中的抗原與免疫親和柱中的抗體發生反應，以提高回收率；（5）在用甲醇洗脫免疫親和柱時，選擇用1 mL或2 mL甲醇不能洗脫完全，而采用3 mL甲醇洗脫時，樣品的回收率最高。 　　清火片（膠囊）目前所執行的標準中尚無AF檢測項，采用本研究建立的HPLC-柱后光化學衍生法進行檢測，4個AF成分的分離度均較高，回收率平行性較好，且最大優點在于將目標成分峰周圍的雜質峰全部清除掉，避免了成分假陽性結果。該方法可以作為清火片（膠囊）檢查AF的依據，同時可為以大黃生藥粉投料的中成藥檢查AF提供一定的參考價值，確保藥品的安全性。雖然目前清火片（膠囊）在AF方面相對較安全，但建議完善其質量標準，增加AF檢查項。筆者在參考2015版《中國藥典》（一部）遠志[19]項下AF的限度后，按清火片（膠囊）一日最大服用量計算，建議AF B1含量不得超過25 ng，AF G2、AF G1、AF B2和AF B1的總量不得超過50 ng。
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